Thạc Sĩ Nghiên cứu quy trình nhận diện một số sản phẩm lúa gạo biến đổi gen bằng kỹ thuật pcr và real – time

MỤC LỤC
TRANG PHỤ BÌA Trang
MỤC LỤC . i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT . iv
DANH MỤC BẢNG . v
DANH MỤC HÌNH ẢNH vi
GIỚI THIỆU . 1
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1. MỘT SỐ VẤN ĐỀ VỀ CÂY TRỒNG BIẾN ĐỔI GEN 3
1.1.1. Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMOs - Genetically Modified
O1rganisms) 3
1.1.2. Quá trình tạo cây trồng biến đổi gen 3
1.1.2.1. Cấu trúc cơ bản của gen chuyển vào thực vật 3
1.1.2.2. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật . 9
1.1.2.3. Thành tựu chuyển nạp gen vào cây trồng 10
1.1.2.4. Lợi ích và tác hại của cây trồng chuyển gen 11
1.1.3. Tình hình cây trồng chuyển gen ở Việt Nam và trên thế giới 1 4
1.1.3.1. Tình hình phát triển 14
1.1.3.2. Dư luận xã hội đối với cây trồng chuyển gen 16
1.1.3.3. Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen 16
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG GMOs 19
1.2.1. Phương pháp dựa vào protein 19
1.2.1.1. Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assays) 19
1.2.1.2. Phương pháp Western Blot 19
1.2.1.3. Lateral flow strip 20
1.2.1.4. Dạng biến đổi của phương pháp miễn dịch (Immunoassay
formats) . 20
1.2.2. Phương pháp dựa vào DNA 21
1.2.2.1. Phương pháp PCR căn bản 21
1.2.2.2. Phương pháp PCR đa thành phần (Multiplex PCR) . 2 1
1.2.2.3. Phương pháp PCR cạnh tranh (Quantitive competitive PCR - QC-
PCR) . 21
1.2.2.4. Real-Time PCR . 22
1.2.3. Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng GMOs 2 7
1.2.3.1. Phương pháp sàng lọc (Screening methods) . 27
1.2.3.2. Phương pháp chuyên biệt gen (Gene-specific methods) 28
1.2.3.3. Phương pháp chuyên biệt cấu trúc (construct-specific methods) 28
1.2.3.4. Phương pháp chuyên biệt sự kiện (event-specific methods) 28
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM . 31
2.1. Điều kiện tiến hành thí nghiệm . 31
2.2. Tiến trình thí nghiệm . 31
2.3. Vật liệu thí nghiệm . 31
2.3.1. Dụng cụ và thiết bị . 31
2.3.2. Hóa chất . 32
2.3.2.1. Hóa chất tách chiết DNA . 32
2.3.2.2. Hóa chất điện di . 32
2.3.2.3. Thành phần phản ứng PCR và Real-Time PCR . 32
2.3.3. Mẫu thí nghiệm . 32
2.4. Phương pháp thí nghiệm . 33
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình tách chiết DNA 33
2.4.1.1. Mục tiêu: . 33
2.4.1.2. Vật liệu . 33
2.4.1.3. Phương pháp thực hiện . 33
2.4.1.4. Phương pháp phân tích sản phẩm DNA tách chiết . 36
2.4.2. Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen . 37
2.4.2.1. Thí nghiệm 2.1: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen dựa vào
promoter 35S. 37
2.4.2.2. Thí nghiệm 2.2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen dựa vào
terminator nos 39
2.4.3. Thí nghiệm 3: Nhận diện gen tham chiếu gos 9 ở gạo . 40
2.4.4. Thí nghiệm 4 : Định lượng p35S bằng Real-Time PCR với thuốc
nhuộm SYBR Green I 42
2.4.4.1. Mục đích . 42
2.4.4.2. Vật liệu thí nghiệm 43
2.4.4.3. Phương pháp thực hiện 43
3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 46
3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình tách chiết DNA 46
3.2. Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 49
3.3. Thí nghiệm 3: Nhận diện gen tham chiếu 50
3.4. Thí nghiệm 4 : Định lượng p35S bằng Real-Time PCR với thuốc nhuộm
SYBR Green I 52
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57
4.1. Kết luận . 57
4.2. Đề nghị 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60
PHỤ LỤC