Luận Văn Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh

MỞ ĐẦU
Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế vừa là cây mô
hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng. Vì vậy,
thuốc lá là một trong những đối tượng được sử dụng nhiều nhất trong các
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đặc biệt là làm đối tượng chuyển gen.
Khảm lá bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá, bệnh khảm lá gây thiệt hại
nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng thuốc lá, nhất lá đối với thuốc lá
sợi vàng. Bệnh khảm thuốc lá do hai loại virus TMV (Tobacco mosaic virus)
và CMV (Cucumber mosaic virus) gây ra. Trong đó, TMV loại virus có phổ
ký chủ rất rộng có tới 230 loài thuộc 32 họ và là một trong virus gây hại trên
thực vật được mô tả sớm nhất ở nước ta.
Những phương pháp thông dụng để khắc phục bệnh khảm lá như sử dụng
giống kháng bệnh, giống sạch bệnh và các biện pháp canh tác( trồng luận
canh cây thuốc lá với cây lúa, vệ sinh đồng ruộng .). Tuy nhiên, những biện
pháp này không những chỉ có tác dụng làm giảm bớt sự lây lan và phát triển
của bệnh, chủ yếu chỉ manh tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh
này mà còn đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và ảnh hưởng xấu tới môi
trường.
Hiện nay, nhờ những tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền mà người ta đã tạo
ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách
đưa gen mã hóa protein vỏ (coat protein gene) của virus vào genome của thực
vật.
Xuất phát từ cơ sở thực tiễn trên, giống thuốc lá C9-1 đã được lựa chọn cho
nghiên cứu “ Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm
tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá” với các nội dung và mục
đích nghiên cứu: (1) Chuẩn hóa phương pháp chuyển gen vào giống thuốc lá
C9-1 thông qua cấu trúc mang chỉ thị gus; (2) Tạo cây thuốc lá chuyển gen
mang cấu trúc TMV-RNAi; (3) Bước đầu phân tích cây chuyển gen bằng
phương pháp PCR

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN 1
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . 2
MỞ ĐẦU . 3
CHưƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ . 4
1.1.1.Phân loại 4
1.1.2. Giá trị của cây thuốc lá . . 5
1.1.3 . Thực trạng phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam . 6
1.2. MỘT SỐ BỆNH THưỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ . 8
1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá . 8
1.2.2. Bệnh khảm lá do virus . 10
1.3. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC 14
1.3.1. Sử dụng giống kháng bệnh: 14
1.3.2.Sử dụng giống sạch bệnh 15
1.3.3. Các biện pháp canh tác 15
1.3.4. Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học . 15
1.3.4.1. Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus . 18
1.3.4.2. Cơ chế hoạt động của RNAi . 18
1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT
NAM. . 19
CHưƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP . 21
2.1. VẬT LIỆU 21
2.1.1.Vật liệu thực vật . . 21
2.1.2.Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen: 21
2.1.3.Hóa chất và thiết bị sử dụng 22
2.2. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm: . 22
2.2.1.1.Khử trùng hạt bằng khí Clo . 22
2.2.1.2. Gieo hạt . . 22
2.2.2.Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium
tumafaciens 23
2.2.2.1.Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium . 2351
2.2.2.2. Tạo nguyên liệu chuyển gen . 23
2.2.2.3.Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy . 23
2.2.2.4.Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen . 24
2.2.2.5.Tạo rễ và cây hoàn chỉnh . 24
2.2.3.Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp nhuộm mô hóa tế bào . 24
2.2.4. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen TMV_RNAi bằng phương
pháp PCR . 25
2.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số 25
2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR . . 25
2.2.5. Phân tích khả năng kháng virus của các cây chuyển gen bằng phương
pháp lây nhiễm nhân tạo . 26
CHưƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 28
3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GENVÀO GIỐNG THUỐC
LÁ C9-1 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMAFACIENS . 28
3.1.1. Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen . 29
3.1.2. Chuyển gen và tái sinh cây . 29
3.1.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium và cảm ứng tạo cụm chồi 29
3.1.2.2. Tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh 32
3.1.3. Phân tích sơ bộ cây chuyển gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào 35
3.2. CÁC KẾT QUẢ BưỚC ĐẦU TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC TMV-RNAi 35
3.2.1. Tái sinh và chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi . 35
3.2.2. Phân tích cây chuyển gen TMV_RNAi kháng virus . 37
3.2.2.1. Phân tích khả năng kháng virus TMV bằng phương pháp lây nhiễm nhân
tạo 37
3.2.2.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây 38
3.2.2.2.1. Kết quả tách ADN tổng số . 38
3.2.2.2.2. Kết quả phản ứng PCR 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO