Báo Cáo Nghiên cứu qui trình nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh để điều trị vô sinh nam giới

MỤC LỤC
Nội dung Trang
CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU 28
CHƯƠNG II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 31
2.1. Tổng quan về phân lập tế bào dòng tinh . 31
2.2. Tổng quan về tế bào nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh 41
2.3. Về tiêu chuẩn đánh giá tế bào gốc sinh tinh trong quá trình nuôi cấy. 57
2.4. Về bảo quản tế bào dòng tinh 73

CHƯƠNG III. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 85
3.1. Đối tượng nghiên cứu: . 85
3.2. Phương pháp nghiên cứu . 86
3.3. Trang bị, hóa chất . 102

CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. 105
4.1. Nghiên cứu về phân lập tế bào dòng tinh từ mào tinh 105
4.2. Nghiên cứu về phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh . 107
4.3. Kết quả nghiên cứu nuôi cấy tế bào dòng tinh . 111
4.3.1. Đặc điểm bệnh nhân . 111
4.3.2. Đặc điểm cấu trúc ống sinh tinh của các bệnh nhân azoospermia 111
4.3.3. Biến đổi số lượng tế bào dòng tinh từ mào tinh trong quá trình nuôi cấy 112
4.3.4. Biến đổi số lượng các tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh trong
quá trình nuôi cấy . 115
4.3.5. Đánh giá tế bào gốc sinh tinh bằng GPF 121
4.3.6. Đánh giá tế bào dòng tinh bằng kỹ thuật FISH 123
4.3.7. Đánh giá tế bào dòng tinh bằng kính hiển vi điện tử . 125
4.3.8. Đánh giá khả năng thụ tinh của các tế bào sau nuôi cấy bằng kỹ
thuật ICSI trên thực nghiệm (n = 100 noãn): . 126
4.3.9. Đánh giá khả năng thụ tinh của các tế bào sau nuôi cấy bằng kỹ
thuật ICSI trên lâm sàng (n = 125 noãn): . 127
4.4. Kết quả nghiên cứu bảo quản tế bào gốc sinh tinh . 129
4.4.1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 130
4.4.2. Thể tích tinh hoàn . 130
4.4.3. Kết quả nghiên cứu trữ lạnh tinh trùng thu nhận từ mào tinh 131
4.4.4. Kết quả nghiên cứu trữ lạnh mô tinh hoàn . 132
4.5. Các qui trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc sinh tinh 138

CHƯƠNG V. BÀN LUẬN. . 157
5.1. Về lựa chọn bệnh nhân qua xét nghiệm mất đoạn nhỏ ở vùng AZF trên NSTY 157
5.2. Về quá trình phân lập tế bào gốc sinh tinh 163
5.3. Nuôi cấy các tế bào dòng tinh thu được từ mào tinh 164
5.4. Nuôi cấy các tế bào gốc sinh tinh 165
5.5. Vai trò của tế bào Sertoli trong nuôi cấy . 166
5.6. Phương pháp nuôi cấy . 166
5.7. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy . 167
5.8. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu bảo quản tế bào gốc sinh tinh 168
5.9. Thể tích tinh hoàn và tế bào gốc sinh tinh lập . 168
5.10. Trữ lạnh các tế bào dòng tinh thu nhận từ mào tinh . 169
5.11. Trữ lạnh tế bào gốc sinh tinh trong mô tinh hoàn của bệnh nhân 176

KẾT LUẬN . 182
KIẾN NGHỊ 184
TÀI LIỆU THAM KHẢO 185
PHỤ LỤC . 201
- Danh sách bệnh nhân PESA, MESA
- Danh sách bệnh nhân trữ lạnh tinh trùng từ mào tinh và mô tinh hoàn

MỞ ĐẦU
Theo các kết quả nghiên cứu tại Việt Nam, thì tỷ lệ vô sinh chung từ 5 - 13%, trong đó vô sinh nam chiếm khoảng 40% [4]. Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam. Trong đó nguyên nhân không có tinh trùng trong tinh dịch (azoospermia) chiếm khoảng 10-20% và là nguyên nhân khó điều trị nhất.
Ở Việt Nam, các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản đã được áp dụng một cách có hiệu quả và đã mang lại hạnh phúc cho hàng ngàn cặp vợ chồng vô sinh. Cùng với sự phát triển chung của lĩnh vực hỗ trợ sinh sản của thế giới, các kỹ thuật mới đã được triển khai và điều trị cho vô sinh nam và vô sinh nữ như các kỹ thuật IVF, ICSI, các kỹ thuật thu tinh trùng cho các bệnh nhân không có tinh trùng trong tinh dịch (azoospermia).
Trong điều trị vô sinh nam, mặc dù có nhiều tiến bộ, nhưng đối với các bệnh nhân azoospermia, đặc biệt là các bệnh nhân azoospermia không do tắc thì hầu như phải xin tinh trùng. Xuất phát từ những cơ sở khoa học trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phân lập, nuôi cấy và biệt hoá tế bào gốc sinh tinh để điều trị vô sinh nam giới. Trong đó phân lập các tế bào gốc sinh tinh là một bước quan trọng, là cơ sở cho những bước tiếp theo. Đã có nhiều tài liệu công bố về nhiều phương pháp phân lập các tế bào dòng tinh khác nhau. Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược điểm khác nhau.
Ngày nay, với các thành tựu trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản, các bệnh nhân azoospermia có thể có con của chính mình bằng tinh trùng thu được từ mào tinh hay ống sinh tinh. Tuy nhiên, các trường hợp không có tinh trùng trong ống sinh tinh và mào tinh vẫn chờ đợi và gặp nhiều khó khăn để có đứa con của chính mình. Trước sự phát triển của khoa học và công nghệ trên thế giới, đã biến những cái không thể thành có thể, nhiều nước trên thế giới đã nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào dòng tinh. Từ đó nhờ kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm-tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (IVF-ICSI) đã hé mở những hy vọng mới cho những trường hợp không có tinh trùng không do tắc
(non-obstructive azoospermia).
Nuôi cấy các tế bào dòng tinh (In Vitro culture of Spermatogenesis cells): là phương pháp điều trị có nhiều triển vọng trong tương lai cho các bệnh nhân không có tinh trùng trong tinh dịch không do tắc NOA (Non Obstructive Azoospermia). Hiện nay trên thế giới một số tác giả đã tiến hành nuôi cấy và đã có được một số thành công bước đầu. Để nâng cao hiệu quả, tính an toàn của phương pháp này, chúng tôi tiến hành phân lập, nuôi cấy tế bào gốc sinh tinh. Kết quả bước đầu cho thấy tế bào gốc sinh tinh phát triển trong môi trường nuôi cấy, phân chia giảm nhiễm tạo thành các tinh tử tròn, tinh tử đang kéo dài và tinh tử đã kéo dài. Tuy nhiên chất lượng tế bào này như thế nào là vấn đề còn tiếp tục được nghiên cứu. Trữ lạnh các tế bào dòng tinh nói chung và tế bào gốc sinh tinh nói riêng giúp cho việc bảo tồn khả năng sinh sản cho nam giới trước khi điều trị các bệnh ác tính bằng phẫu thuật, hoá chất, tia xạ cũng như một số bệnh lý mạn tính như tiểu đường, rối loạn miễn dịch. Ngoài ra trữ lạnh tinh trùng lấy từ mào tinh và mô tinh hoàn giúp cho tránh khỏi sinh thiết tinh hoàn nhiều lần
dế gây ra các biến chứng và tạo áp lực lớn về tâm lý cho bệnh nhân [26]. Việc trữ lạnh tinh trùng đã trở thành thường qui trong các trung tâm hỗ trợ sinh sản, tuy nhiên việc trữ lạnh tế bào gốc sinh tinh còn nhiều vấn đề còn tiếp tục nghiên cứu.
Ðây là một nghiên cứu có khoa học, tính nhân văn. Kết hợp với quá trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc sinh tinh, mở ra triển vọng cho những bệnh nhân không có tinh trùng trong tinh dịch có thể có cơ hội có những đứa con của chính mình. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến
hành nghiên cứu đề tài với 3 mục tiêu như sau:
1. Xây dựng qui trình phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh và các tế bào dòng tinh từ mào tinh ở bệnh nhân nam giới vô sinh do không có tinh trùng,
2. Xây dựng qui trình bảo quản, nuôi cấy và biệt hoá tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh và các tế bào dòng tinh từ mào tinh thành tinh trùng,
3. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá tế bào gốc sinh tinh và tinh trùng được biệt hoá từ tế bào gốc sinh tinh.
Mục tiêu cụ thể là xây dựng các qui trình và tiêu chí đánh giá tế bào như sau:
1. Qui trình thu gom, phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh,
2. Qui trình thu gom, phân lập các tế bào dòng tinh từ mào tinh,
3. Qui trình nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tinh,
4. Qui trình nuôi cấy, biệt hóa các tế bào dòng tinh từ mào tinh,
5. Tiêu chuẩn đánh giá tế bào gốc sinh tinh và các tế bào dòng tinh sau nuôi cấy,.
6. Qui trình bảo quản các tế bào gốc sinh tin