Thạc Sĩ Nghiên cứu quá trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít

MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Axit lactic là axit hữu cơ không màu, có hương vị nhẹ. Axit lactic được hình
thành do quá trình lên men tự nhiên trong các sản phẩm như phomai, sữa chua,
nước tương, bột chua, sản phẩm từ thịt, rau muối chua Axit lactic được dùng sản
xuất trong một số thực phẩm như các sản phẩm bánh, đồ uống, các sản phẩm từ
sữa, thịt, xà lách .Trong các sản phẩm thực phẩm đồ uống, axit lactic được sử dụng
để điều chỉnh độ pH hoặc như một chất bảo quản [27], [30].
Trong công nghiệp nhẹ, axit lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn,
vecni, nhuộm và thuộc da. Trong công nghiệp rượu, axit lactic được dùng dưới
dạng muối của canxi. Đặc biệt là gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên
cứu tổng hợp nhựa axit polylactic (PLA) – một loại nhựa sinh học từ axit lactic.
PLA là sự lựa chọn thích hợp thay cho nhựa có nguồn gốc từ dầu mỏ, vì nó vừa có
thể phân huỷ được, vừa ít độc tính đối với con người. PLA được sử dụng làm
nguyên liệu sản xuất bao bì phân bón, thực phẩm và các loại bát, đĩa dùng một lần.
Đặc biệt trong y học và dược học, kết hợp với sự phát triển của công nghệ sinh học
và di truyền, axit lactic được nghiên cứu nhằm sản xuất phục vụ những nhu cầu
thiết yếu về sức khỏe của con người. Trong phẫu thuật chỉnh hình, các hợp chất cao
phân tử tổng hợp từ axit lactic và những dẫn xuất của nó là những chất liệu cấy
ghép sinh học thích hợp và hiệu quả cao. Canxi lactat là loại dược phẩm nhằm bổ
sung canxi dưới dạng dễ hấp thu cho cơ thể. Sắt lactat được sử dụng để chữa bệnh thiếu
máu [16], [28], [37].
Axit lactic được sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như rỉ đường,
củ cải đường, nước mía, tinh bột . Nhằm để hạ chi phí sản xuất axit lactic, ngày
nay đang có rất nhiều nghiên cứu thay thế nguồn cacbon và nitơ đắt tiền trong môi
trường lên men bằng các nguyên vật liệu rẻ tiền hơn. Trong đó, tập trung chủ yếu - 2 -
vào việc tận dụng các phế phẩm nông nghiệp như bã mía, bã ngô, lõi ngô, cám mỳ,
rơm rạ, rỉ đường .[16],[23],[28],[36].
Mít là loại trái cây nhiệt đới có giá trị. Quả mít đã được sử dụng để ăn tươi từ
lâu đời. Trong những năm gần đây mít được sử dụng rất nhiều trong các ngành chế
biến thực phẩm để tạo ra các sản phẩm khác nhau như: mứt mít, mít sấy, sản xuất
bánh kẹo, Hạt mít ở trong quả mít chiếm trung bình từ 10 – 15% trọng lượng trái,
ngoài ra trong hạt mít chứa một hàm lượng khá lớn tinh bột và protein. Mặc dù
khối lượng nhiều nhưng nó chỉ được coi là phế phụ phẩm và thường bị loại bỏ
trong quá trình sử dụng, sản xuất và gây khó khăn cho việc xử lý rác thải ô nhiễm
môi trường . Chúng ta đã biết sử dụng hạt mít để chế biến một số món ăn nhỏ tuy
nhiên sự hiểu biết về các thành phần dinh dưỡng còn hạn chế [35].
Quá trình nghiên cứu xác định thành phần dinh dưỡng của hạt mít đã được
khảo sát trong thời gian gần đây, trong hạt mít có chứa tới 77,76% tinh bột và là
một nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có [38], [43]. Thủy phân tinh bột từ hạt mít để
lên men sản xuất cồn và axit lactic là một hướng mới nhưng chưa được nghiên cứu nhiều.
Việc tận dụng được nguồn phụ phẩm rẻ tiền, dễ kiếm, cũng như nhằm hạn
chế lượng chất thải trong quá trình chế biến, chống ô nhiễm môi trường là một
thiên hướng lớn đối với các nhà nghiên cứu. Trong công nghệ sản xuất axit lactic,
việc sử dụng các nguồn nguyên liệu như đường, rỉ đường, nước mía ép, củ cải
đường, tinh bột đã được nghiên cứu nhiều nhưng hiện nay việc sử dụng tinh bột
hạt mít để sản xuất axit lactic thì chưa thấy công bố.
Ở nước ta, việc sử dụng axit lactic trong công nghệ thực phẩm và phi thực
phẩm khá nhiều nhưng chủ yếu là thu mua từ nước ngoài với giá thành cao.
Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột hạt mít (một nguồn phế phẩm công nghiệp
khổng lồ và rẻ tiền) để làm nguyên liệu trong công nghệ lên men lactic nhằm hạ giá
thành cho sản phẩm axit lactic là thật sự có ý nghĩa không chỉ về mặt kinh tế mà
còn có ý nghĩa rất lớn về bảo vệ môi trường sống của chúng ta.
Chính vì những thực tế trên, chúng tôi mạnh dạn chọn đề tài “Nghiên cứu quá
trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít” là một việc làm cấp thiết hiện nay.- 3 -
2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
- Sử dụng hạt mít làm nguyên liệu chính để tiến hành thủy phân thu nhận dịch lên men.
- Xác định các thông số công nghệ tốt nhất như nồng độ dịch đường, nhiệt
độ lên men, thời gian lên men, pH lên men cho quá trình lên men axit lactic bằng
cách sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa nhằm thu được
hàm lượng axit lactic sau lên men là cao nhất.
- Đề xuất được quy trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít.
3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Sử dụng hạt mít làm nguồn nguyên liệu chính để tiến hành thủy phân thu
nhận dịch đường.
- Sử dụng chế phẩm enzyme α-amylaza do hãng Novozymes – Đan Mạch sản
xuất và chế phẩm γ-amylaza của Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất.
- Sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacillus casei để lên men dịch sau thủy phân.
4. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Sử dụng hạt mít được thu mua tại các đầu mối nguyên liệu của Công ty cổ
phần Vinamit trên Daklak.
- Lên men axit lactic từ dịch thủy phân từ tinh bột hạt mít.
5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phương pháp lấy mẫu, chuẩn bị mẫu và bảo quản mẫu.
- Phương pháp hóa lý
- Phương pháp hóa học
- Phương pháp hóa sinh
- Phương pháp vi sinh vật
- Phương pháp toán học
6. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
- Phân tích và xác định hàm lượng tinh bột của hạt mít, thành phần dịch lên
men và xác định hàm lượng axit lactic bằng các phương pháp hóa học.
- Thực hiện lên men axit lactic trên môi trường lỏng. - 4 -
- Tối ưu hóa các điều kiện lên men bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm và phương pháp tối ưu nhằm thu được hàm lượng axit lactic là cao nhất.
7. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
- Tận dụng lượng phế phụ phẩm trong quá trình chế biến các sản phẩm từ
quả mít để tạo ra nguồn nguyên liệu chính để sản xuất axit lactic.
- Giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng đồng,
nâng cao hiệu quả kinh tế trong sản xuất.
- Tăng nguồn thu nhập cho người trồng mít
- Giảm lượng axit lactic ngoại nhập, chủ động sản xuất, tiết kiệm ngoại tệ.
8. CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN
Ngoài phần mở đầu, kết luận và kiến nghị, tài liệu tham khảo, phụ lục, trong
luận văn gồm có các chương sau:
+ Chương 1: Tổng quan.
+ Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu.
+ Chương 3: Kết quả và thảo luận. - 5 -
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về axit lactic
1.1.1. Lịch sử lên men lactic
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí đường tạo thành axit lactic đã
được biết và sử dụng từ lâu đời trong dân gian như: lên men chua rau quả, làm sữa chua
Năm 1780 nhà bác học Thụy Điển Shale lần đầu tiên đã tách được axit lactic
từ sữa bò lên men chua. Năm 1857 Pasteur đã chứng minh được sự lên men chua
sữa là do nhóm vi khuẩn lactic. Năm 1878 Lister phân lập thành công vi khuẩn
lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactis, nay gọi là Streptococus lactic. Về sau
các nhà khoa học liên tiếp phân lập được nhiều loại vi khuẩn lactic khác nhau. Từ
đó công nghiệp lên men sản xuất axit lactic được hình thành từ năm 1881 [1], [3].
Ngày nay, việc sản xuất và tiêu thụ axit lactic trên thế giới khá nhiều. Vì axit
lactic được lên men từ nhiều nguyên liệu khác nhau, chủ yếu là những nguyên liệu
có chứa tinh bột, đường và nguyên liệu có khả năng chuyển hóa thành đường. Hơn
nữa, đa số các loại nguyên liệu này thường là phế phẩm trong nhiều ngành công
nghiệp như rỉ đường, rơm rạ [16], [25], [28], [36].
1.1.2. Cấu tạo của axit lactic
Công thức phân tử: C 3 H 6 O 3 , khối lượng phân tử là 90,08; tỉ trọng 1,21;
nhiệt độ sôi 122 o C; điểm tan 18 o C [1]. Axit lactic là hỗn hợp của 2 dạng đồng phân
D-axit lactic và L-axit lactic:
D-axit lactic L-axit lactic
Hình 1.1. Hai dạng đồng phân của axit lactic [52]. - 6 -
Axit lactic là axit hữu cơ không màu, có mùi nhẹ, tan trong nước và trong
cồn. Trong cấu tạo phân tử của chúng có một cacbon bất đối xứng nên chúng có
hai đồng phân quang học: D-axit lactic và L-axit lactic. Hai đồng phân quang học
này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng
phân cực ánh sáng, một quay sang phải và một quay sang trái. Do đó tính chất sinh
học của chúng hoàn toàn khác nhau.
Loại L-axit lactic ở dạng tinh thể không màu. Chúng có khả năng tan trong
nước, tan trong cồn etylic, tan trong eter, không tan trong CHCl 3 . Nhiệt độ nóng
chảy là 28 o C, góc quay cực ở 15 o C là 2,67 o .
Loại D-axit lactic là dạng tinh thể, tan trong nước, tan trong cồn. Nhiệt độ
nóng chảy là 28 o C, nhiệt độ sôi 103 o C, góc quay ở 15 o là -2,26 o .
Nếu D-axit lactic và L-axit lactic có trong hỗn hợp theo tỉ lệ 50:50, người ta
gọi là hỗn hợp raxemic. Hỗn hợp này được kí hiệu là DL-axit lactic. Trong quá
trình lên men không có một hỗn hợp lý tưởng này mà chỉ có được hỗn hợp này khi
tiến hành tổng hợp hữu cơ. DL-axit lactic là dịch lỏng dạng sino, có khả năng tan
trong nước, trong cồn, không tan trong CHCl 3 , nhiệt độ nóng chảy của chúng là
16,8 o C, nhiệt độ sôi là 122 o C [1], [3].
1.1.3. Cơ sở của qúa trình lên men axit lactic
Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong quá trình lên men lactic là những phản
ứng chuyển hydro và điện tử. Các enzyme xúc tác quá trình tách nguyên tử hydro
khỏi cơ chất là các enzyme oxy hóa – khử (dehydrogenase, oxydase ) chủ yếu từ
vi sinh vật. Như vậy, lên men là quá trình oxy hóa - khử sinh học để thu năng lượng
và các hợp chất trung gian. Tùy thuộc vào các sản phẩm tạo thành mà quá trình lên
men lactic được chia thành 2 loại: lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị
hình [8], [11].
Lên men lactic đồng hình, thực tế chỉ xuất hiện axit lactic, còn trong lên men
dị hình các sản phẩm cuối cùng khá đa dạng: axit lactic, etanol, axit axetic và CO 2 .
Chỉ có lên men lactic đồng hình là có ý nghĩa về mặt công nghiệp. - 7 -
Các vi khuẩn lactic đồng hình phân giải glucose theo con đường EMP [3].
Tùy thuộc vào tính chuyển hóa không gian của men xúc tác cho phản ứng tạo axit
lactic, lactac dehdrogenase, và tùy vào sự tồn tại của men lactate-racemase mà có
thể xuất hiện các dạng decacboxyl hóa và chuyển thành axit axetic, etanol và CO 2
cũng như tạo thành axeton. Mức độ tạo thành sản phẩm này phụ thuộc vào sự có
mặt của oxi.
Sự hình thành nên axit lactic trải qua hàng loạt giai đoạn trung gian với sự
tham gia của các enzyme tương ứng. Các phản ứng chuyển hóa glucose theo con
đường EMP được chia làm 2 giai đoạn:
- Giai đoạn đầu được gọi là giai đoạn đầu tư năng lượng, gồm 5 phản ứng
đầu tiên. Ở giai đoạn này, đường được hoạt hóa bởi sự photphoril hóa. Phản ứng
này tạo ra 1 mol đường 6 cacbon đã được photphoril hóa, fructozo – 1,6 –
diphotphat. Đường này sau đó được cắt thành 2 mol trizophotphat. Hai mol
trizophotphat được hình thành từ 1 mol glucose sau 2 lần photphoril hóa mức độ
cơ chất tạo thành 4 mol ATP.
- Giai đoạn thứ hai, là giai đoạn phát sinh năng lượng. Giai đoạn này gồm
những phản ứng còn lại. Ở giai đoạn này, các trizophotphat sẽ được hoạt hóa tiếp
để tạo thành hai hợp chất chứa các liên kết photphat cao năng 1,3-
diphotphoglycerat và photpho enolpiruvat. Cả hai hợp chất này được coi như hợp
chất siêu cao năng lượng. Hai chất này sẽ chuyển photpho cao năng cho ADP để
tạo thành ATP. Quá trình này được gọi là photphoril hóa ở mức cơ chất.
Lượng axit lactic tạo thành chiếm hơn 90%. Chỉ một lượng nhỏ pyruvat bị
khử cacbon để chuyển thành axit lactic, etanol, CO 2 và axeton [1], [3].
Phương trình phản ứng tạo axit lactic: C 6 H 12 O 6 = 2CH 3 CHOHCOOH
+225cal. Sự lên men lactic đồng hình được biểu diễn theo sơ đồ sau: - 8 -
Glucose
Gluco-6- photphat
Fructo-1,6-diphotphat
Glyceraldehyt-3-photphat
Dihydroaxeton photphat
NAD
NADH 2
1,3-Diphotphoglyxerat
3-Photphoglyxerat
2-Photphoglyxerat
Photphoenol pyruvat
Pyruvat
NADH 2
NAD
Lactat
Hình 1.2. Lên men axit lactic đồng hình nhờ các phản ứng theo con đường EMP [3].
Các vi khuẩn lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con đường EMP,
do bị đột biến một hoặc nhiều hơn một enzyme của con đường này, đó là aldolase
và trizophotphatizomerase. - 9 -
Hình 1.3. Lên men axit lactic dị hình theo các phản ứng của con đường PP [4].
Trong sự lên men lactic dị hình, nhiều sản phẩm khác nhau được tạo thành. Các
tác nhân gây lên men lactic dị hình là Lactobacillus brevis, Leuconostoc mensenteroides.- 10 -
Sự lên men lactic dị hình xảy ra khi vi khuẩn gây lên men thiếu enzyme cơ bản
của sự đường phân là aldolase và trioso isomerase. Khi đó, glucose được chuyển hoá
theo con đường pentosophosphat từ glucoso 6 phosphat đến xiluloso 5 phosphat. Sau đó,
dưới tác dụng của enzyme pentosophosphat cetolase mà xiluloso 5 phosphat bị phân ly
tạo thành glyceraldehyd 3 phosphat và acetyl phosphat. Acetyl phosphat có thể được
chuyển hoá tiếp tục thành ethanol hoặc axit axetic tuỳ theo hệ enzyme của từng vi sinh
vật. Còn glyceraldehyd 3 phosphat thì bị khử H 2 để chuyển thành axit lactic giống như
trường hợp lên men lactic đồng hình.
Sự lên men lactic dị hình được ứng dụng trong lên men thức ăn gia súc và muối
chua rau quả. Các vi khuẩn có khả năng gây lên men các đường mono và disaccharid
(sau khi đã thuỷ phân thành monosaccharid nhờ enzyme t ơng ứng của vi khuẩn).
1.2. Tác nhân tổng hợp axit lactic
Vi sinh vật là tác nhân chủ yếu gây nên sự lên men. Trong tế bào vi sinh vật
có một hệ enzyme rất phức tạp. Tuy nhiên, không phải tất cả vi sinh vật đều có khả
năng tổng hợp một phức hệ enzyme như nhau. Nhiều thí nghiệm nghiên cứu các
enzyme riêng biệt có nguồn gốc từ vi sinh vật chứng tỏ rằng ngay cả cùng một loài,
khác nhau về lượng enzyme tổng hợp được. Vì vậy, việc tuyển chọn chủng có hệ
enzyme đặc trưng cho một sản xuất nào đó luôn luôn liên quan tới việc khảo
nghiệm hàng chục, hàng trăm loài vi sinh vật khác nhau. Để có được chủng ứng
dụng cho từng sản xuất riêng là vấn đề khó khăn, phức tạp và lâu dài [1].
1.2.1. Phân loại vi khuẩn lactic
Theo khóa phân loại Bergey, nhóm vi khuẩn lactic thuộc:
Giới: Bateria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillates
Họ: Lactobacillaceae & Streptococcaceae
Vi khuẩn lactac có chung các điểm như: bắt màu gram (+), không di động,
không tạo bào tử (dù vậy, ngày nay người ta tìm thấy một số vi khuẩn sinh axit - 11 -
lactic có khả năng tạo bào tử), nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, kị khí tùy ý, tế bào
không chứa cytochobrom và enzyme catalase, lên men tổng hợp axit lactic [1], [5].
Bảng 1.1. Hình thái và kiểu lên men lactic của một số vi khuẩn lactic [1], [3].
Giống vi sinh vật Kiểu Sản phẩm chính Cấu hình
lên men (tỉ lệ phân tử) axit lactic
Trực khuẩn
Lactobacillus lactic đồng hình lactat D(-)
L. helveticus đồng hình lactat DL
L. acidophilus đồng hình lactat D(-)
L. bulgaricus đồng hình lactat D(-)
L. delbrueckii đồng hình latcat D(-)
L.casei đồng hình latcat L(-)
L. plantarum đồng hình lactat DL
L. brevis dị hình - DL
L. fermentum dị hình - DL
L. viridescens dị hình - DL
Bifidobacterium bifidum dị hình lactat: acetat(2:3) L(+)
Cầu khuẩn
Stretoccus đồng hình lactat L(+)
S. faeclis đồng hình lactat L(+)
S. salivarius đồng hình lactat L(+)
S. pyogenes đồng hình lactat L(+)
S. cremoris đồng hình lactat L(+)
S. thermophilus đồng hình lactat L(+)
S. diacetilactics đồng hình lactat L(+)
Pediococcus cerevisiae đồng hình lactat DL
Leuconostoc cremoris dị hình lactat : acetat : CO 2 (1:1:1) D(-)
Leuconostoc mesenteroides dị hình lactat : acetat : CO 2 (1:1:1) D(-) - 12 -
Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều loài khác nhau về hình dạng, song về
mặt sinh lý và khả năng lên men chúng tương đối đồng nhất. Môi trường sinh
trưởng của chúng ngoài gluxit, khoáng, muối amon, photphat còn cần vitamin
nhóm B, vitamin H, axit folic, axit nicotinic và axit amin khác [1], [11].