Báo Cáo Nghiên cứu phát triển vaccine thực vật dùng qua đường miệng cho gia cầm phòng chống bệnh H5N1 ở Việt

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
NĂM 2010

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. CÚM VÀ VIRUS CÚM H5N1 3
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÚM H5N1 Ở VIỆT NAM 4
1.3. VACCINE VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG DỊCH CÚM A/H5N1 7
1.4. CÂY ĐẬU TƯƠNG 10
1.5. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG 11
1.6. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 11


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. VẬT LIỆU 13
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.2.1. Các phương pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh và chuyển gen in vitro 14
2.2.2. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen 18
2.2.3. Các phương pháp phân tích cây biến nạp 23
2.2.4. Kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch với hạt chuyển gen trên động vật 24


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30
3.1. TỐI ƯU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG 30
3.1.1 Tối ưu thời gian khử trùng hạt 30
3.1.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi từ lá mầm hạt chín 32
3.1.3. Ảnh hưởng của hocmon sinh trưởng (GA3, IAA) tới khả năng kéo dài chồi
3.1.4. Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả tạo rễ 37
3.1.5. Xác định giá thể thích hợp cho ra cây in vitro 39
3.1.6. Ngưỡng sống sót của cây đậu tương in vitro trên môi trường chứa kanamycin 41
3.1.7. So sánh khả năng tái sinh phục vụ chuyển gen của 2 giống đậu tương ĐT12 và DT84
3.1.8. Kết quả chuyển gen gus 47
3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN 50
3.2.1. Thiết kế và tổng hợp gen HA 50
3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện đặc trưng trong hạt 52
3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện mạnh trong toàn bộ cây 60
3.3. CHUYỂN GEN 63
3.3.1. Biến nạp các cấu trúc vào A.thaliana 63
3.3.2. Biến nạp vào cây thuốc lá 66
3.3.3. Biến nạp vào cây đậu tương 68
3.4. KIỂM TRA MỨC ĐỘ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN ĐỘNG VẬT 73
3.4.1 Kiểm tra khả năng ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên 73
3.4.2. Kiểm tra sơ bộ khả năng đáp ứng miễn dịch trên chuột 73
3.4.3. Kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch trên gà 74


CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ ĐỀ TÀI 78
4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC 78
4.2. KẾT QUẢ NỔI BẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG 79
4.3. ĐÀO TẠO 80
4.4. DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 80
4.5. QUYẾT TOÁN KINH PHÍ 81
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 83
TÀI LIỆU THAM KHẢO 85
PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU
Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao trên khắp thế giới. Hằng năm dịch cúm đã làm cho nửa tỷ người mắc bệnh, chủ yếu là trẻ em. Hiện nay, cúm H5N1- chủng virus nguy hiểm nhất trên gia cầm đã lan truyền trên 40 quốc gia ở Châu Á, Trung Đông, Châu Âu và Châu Phi. Chủng này mới xuất hiện gần đây nhưng là một loại subtype có độc lực cao, được chứng minh là có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gà những năm 1996-2005. Ở nước ta, dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra từ những tháng cuối năm 2003 và đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm và người. Theo tổng kết của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), Việt Nam là nước có số
người mắc bệnh và tử vong cao nhất trong số 8 nước có dịch xảy ra ở Châu Á. Dịch cúm gia cầm hàng năm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm A luôn biến đổi và thích ứng, cũng như nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là chim di cư và thuỷ cầm rất khó khống chế. Hiện nay, việc phòng chống virus cúm A nói chung và H5N1 nói riêng, ngoài các biện pháp phòng chống dịch một cách tiên quyết như tiêu độc, xử lý gà bệnh, thanh lý gà nhiễm hoặc nguy cơ nhiễm, tìm kiếm và sử dụng vaccine vẫn là hướng thiết yếu nhất để khống chế và ngăn chặn lây lan sang người. Có nhiều loại vaccine đang được sử dụng và nghiên cứu bao gồm cả vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng các phương pháp tái tổ hợp và di truyền ngược. Tuy nhiên các loại vaccine này vẫn có những nhược điểm khó khắc phục như giá thành cao, khó bảo quản và không an toàn. Do vậy các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine mới có tính ưu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản và phân phối hơn, an toàn và hiệu quả hơn. Vaccine ăn được có nguồn gốc từ thực vật sẽ là nguồn vaccine đáp ứng được các
yêu cầu đó và sẽ đem lại nhiều hứa hẹn. Vaccine ăn được là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine ăn được nguồn gốc thực vật có hoạt tính tương tự như vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt. Vaccine này có một số ưu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác gồm vaccine có thể ăn tươi hoặc nấu chín; dễ dàng sản xuất khối lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây chuyển Báo cáo tổng kết đề tài
– Mở đầu
Thời gian thực hiện 2007-2009 2 gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine này có tính ổn định an toàn cao, dễ bảo quản, sử dụng và kinh tế. Như vậy để tiến tới sản xuất được vaccine ăn được phục vụ cho việc phòng chống bệnh dịch như dịch cúm gà hiện nay thì cần phải có một chiến lược, một kế hoạch nghiên cứu để đưa ra quy trình công nghệ sản xuất. Trong những năm gần đây, với sự phát triển của công nghệ sinh học nói chung và công nghệ tế bào thực vật nói riêng, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã thành công tạo ra một số sản phẩm y dược trong cây trồng chuyển gen. Từ sự cấp thiết của tình hình hiện nay và trên cơ sở một số thành công trong tạo cây chuyển gen trên một số cây trồng, chúng tôi hợp tác với trường Đại học Tự do (Vương quốc Bỉ) tiến hành thực hiện nhiệm vụ: “Nghiên cứu phát triển vaccine thực vật dùng qua đường miệng cho gia cầm phòng chống bệnh H5N1 ở Việt Nam”.