Báo Cáo Nghiên cứu phát triển và ứng dụng công nghệ tế bào gốc để điều trị một số bệnh về tim mạch, cơ quan

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
NĂM 2011

MỤC LỤC ( dài 243 trang)
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU 1
NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC HIÊN 11
Phần 1: Cơ sở lý thuyết 11
Nhánh 1 11
1. Tế bào gốc tủy xương 11
1.1. Sự “mềm dẻo” của tế bào gốc tủy xương 11
1.2. Quá trình biệt hóa của tế bào gốc tủy xương 11
1.3. Sự biệt hóa linh động của tế bào gốc tủy xương 12
1.4. Một số giả thuyết về tính mềm dẻo của TB gốc tủy xương
2. Tế bào gốc trung mô 14
2.1. Hình thái tế bào 15
2.2. Đặc điểm kiểu hình miễn dịch 15
3. Tế bào cơ tim và cách nhận biết tế bào cơ tim 18
3.1. Cấu tạo và hình thái của tế bào cơ tim trưởng thành 18
3.2. Cách nhận biết, đánh giá TB cơ tim nuôi cấy in vitro 19
Nhánh 2 21
1. Tế bào gốc từ máu cuống rốn 21
2. Tế bào gốc từ màng dây rốn 21
Nhánh 3 22
1. TB gốc trung mô từ TM dây rốn ở người 22
1.1. Cấu trúc của dây rốn 22
1.2. TB gốc trung mô từ TM dây rốn ở người 23
2. Tế bào gốc phôi 25
2.1. Đặc điểm của tế bào gốc phôi 25
2.2. Các nguồn thu nhận tế bào gốc phôi 25
2.3. Các marker nhận biết tế bào gốc phôi 26
2.4. Ứng dụng của tế bào gốc phôi 27
3. Bức xạ ion hóa và khả năng nghiên cứu TB gốc trên chuột chiếu xạ
3.1. Các cơ quan tạo máu ở động vật 28
3.2. Ảnh hưởng của bức xạ ion hóa đến sự thay đổi máu và hệ tạo máu
3.3. Tác động của bức xạ ion hóa trên chuột và mô hình thửnghiệm với tế bào gốc
Nhánh 4 32
1. Xuất xứ của đề tài 32
2. Cấu tạo của bề mặt nhãn cầu 33
2.1. Sơ lược giải phẫu lớp mặt ngoài của nhãn cầu 33
2.2. Định nghĩa bề mặt nhãn cầu 33
2.3. Những nghiên cứu về nuôi cấy TB biểu mô vùng rìa và ứng dụng
Nhánh 5 45
1. Xuất xứ của đề tài 45
2. Ghép TB gốc tạo máu trong điều trị các bệnh ác tính của cơ quan tạo máu
2.1. Các loại ghép HSC 46
2.2. Ghép TB gốc tạo máu trong điều trị các bệnh ác tính của
cơ quan tạo máu
Nhánh 6 54
1. Xuất xứ của đề tài 54
2. Các nguồn TB gốc được sử dụng để điều trị thử nghiệm các bệnh tim mạch
3. Các đường cấy tế bào gốc 58
4. Các KQ ứng dụng TB gốc trong điều trị suy tim do NMCT 59
Phần 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 62
Các kết quả đạt được 69
Nhánh 1 69
1. Phân lập, nuôi cấy, định danh MSC từ tủy xương người 69
1.1. Phân lập MSC từ tủy xương người 69
1.2. Kết quả phân lập và nuôi cấy dài ngày MSC từ tủy xương 70
1.3. Xác định tế bào bằng marker bề mặt 72
2. Kết quả nghiên cứu biệt hóa MSC theo hướng TB cơ tim 75
2.1. Biểu hiện gen đặc trưng của TB cơ xương, cơ tim của
MSC biệt hóa theo hướng cơ tim 75
2.2. Kết quả phân tích hình ảnh siêu cấu trúc tế bào 78
2.3. Kết quả định loại protein bào tương của MSC sau biệt hóa
Nhánh 2 80
1. Phân lập tế bào gốc từ máu cuống rốn 80
2. Nuôi cấy tế bào gốc được phân lập từ máu cuống rốn 81
3. Xác định TB gốc trung mô từ máu cuống rốn bằng kĩ thuật sinh học phân tử
Nhánh 3 86
1. Kết quả gây mô hình bệnh chết tủy và điều trị thử nghiệm bằng tế bào gốc trên chuột
1.1. Ảnh hưởng của chiếu xạ lên chuột nhắt trắng 86
1.2. Sự thay đổi trọng lượng trung bình, thời gian sống trung bình và độ sống sót của chuột trong 30 ngày sau khi chiếu xạ.
1.3. Sự thay đổi số lượng bạch cầu máu ngoại vi chuột nhắt trắng sau chiếu xạ
1.4. Nghiên cứu sự thay đổi số lượng, thể tích trung bình hồng cầu máu ngoại vi của chuột khi bị chiếu xạ 87
1.5. Tác động của chiếu xạ lên cấu trúc lách chuột 89
1.6. Đánh giá ảnh hưởng của tế bào gốc phôi chuột (mESC) khi được cấy ghép vào chuột chiếu xạ 92
1.7. Khả năng kéo dài tuổi thọ chuột chiếu xạ liều chết của mESC
1.8. Xét nghiệm tế bào tuỷ xương sau chiếu xạ và ghép tế bào gốc
1.9. Nghiên cứu cấu trúc lách chuột sau chiếu xạ và ghép tế bào gốc
1.10. Đánh giá về kết quả gây mô hình 98
2. Kết quả phân lập, nhận biết, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc phôi chuột
2.1. Chuẩn bị lớp tế bào nuôi 98
2.2. Kích thích chuột siêu bài noãn và thu nhận phôi chuột 100
2.3. Phân lập và nuôi cấy túi phôi 101
2.4. Phân tách những cụm tế bào nút phôi sinh trưởng mạnh 105
2.5. Nhận biết mESC bằng phương pháp nhuộm AP 108
2.6. Nhận biết mESCs nuôi cấy in vitro bằng marker đặc hiệu Oct3/4
110
2.7. Bảo quản và phục hồi mESC 113
2.8. Đánh giá về kết quả phân lập, nhận biết, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc phôi chuột
115
3. Kết quả đánh dấu, đánh giá sự di chuyển của tế bào gốc cấy ghép trên cơ thể chủ, hiệu quả cấy ghép vào động vật chết tuỷ do chiếu xạ 116
3.1. Kết quả phân lập và nuôi cấy tế bào gốc phôi 116
3.2. Kết quả xác định giới tính của tế bào gốc 117
3.3. Kết quả xác định thời gian sống của chuột chiếu xạ 118
3.4. Kết quả xác định sự có mặt của tế bào gốc ở các cơ quan chuột chiếu xạ được tiêm tế bào gốc phôi. 119
4. Kết quả phân lập, nuôi cấy, nhận biết và bảo quản tế bào gốc nội mô mạch máu dây rốn trẻ sơ sinh 122
4.1. Kết quả phân lập và nuôi cấy tế bào nội mô (hUVEC) 122
4.2. Bảo quản lạnh và phục hồi thành công tế bào nội mô 126
5. Kết quả phân lập và nuôi cấy MSC từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn trẻ sơ sinh
5.1. Kết quả phân lập MSC từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn trẻ sơ sinh 128
5.2. Kết quả nuôi cấy MSC từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn trẻ sơ sinh 129
5.3. Kết quả phân biệt các tế bào nội mô với TB gốc trung mô 132
5.4. Kết quả bảo quản và phục hồi MSC thu từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn trẻ sơ sinh
5.5. Đánh giá chất lượng MSC thu từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn trẻ sơ sinh sau bảo quản lạnh 136
6. Kết quả biệt hóa tế bào gốc MSC phân lập từ nội mô mạch máu dây rốn trẻ sơ sinh 137
6.1. Đánh giá mức độ thuần nhất của quần thể MSC trước khi biệt hóa 137
6.2. MSC được biệt hóa định hướng thành tế bào dạng cơ tim 140
Nhánh 4 148
1. Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm nền nuôi cấy. 148
1.1. Lựa chọn màng ối 148
1.2. Lựa chọn phương pháp xử lý màng ối 150
2. Qui trình tạo tạo tấm biểu mô giác mạc từ mẫu mô sinh thiết của bệnh nhân
3. Qui trình nhận biết, nuôi cấy tế bào gốc giác mạc người. 153
3.1. Cấu trúc vi thể của tấm biểu mô nuôi cấy 154
3.2. Cấu trúc siêu vi của tấm biểu mô nuôi cấy 155
3.3. Cấu trúc hoá học của tấm biểu mô nuôi cấy 156
4. Ghép thực nghiệm cho thỏ 157
4.1. Mô hình gây bỏng cho thỏ 157
4.2. Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho thỏ 158
5. Qui trình ghép tấm biểu mô nuôi cấy cho bệnh nhân tình nguyện. 161
5.1. Đặc điểm tình hình bệnh nhân (Bảng 3.4) 161
5.2. Đặc điểm tổn thương mắt trước phẫu thuật ghép tấm biểu mô 162
5.3. Thời gian nuôi cấy tấm biểu mô 162
5.4. Kết quả phẫu thuật tại các thời điểm theo dõi 163
6. Xây dựng tiêu chuẩn tấm biểu mô giác mạc người nuôi cấy 164
6.1. Điều kiện 164
6.2. Tiêu chuẩn tấm biểu mô giác mạc vùng rìa nuôi cấy 164
Nhánh 5 165
1. Đặc điểm của bệnh nhân nghiên cứu 165
2. Kết quả nghiên cứu một số qui trình kĩ thuật áp dụng trên bệnh nhân MM ghép PBSC 166
2.1. Kết quả huy động PBSC (TB CD34+) ra máu ngoại vi 166
2.2. Kết quả tách, thu gom tế bào PBSC (CD34 +) 169
2.3 Kết quả xử lý và bảo quản khối PBSC 172
3. Kết quả ghép PBSC tự thân trong điều trị MM 174
3.1. Mọc ghép và phục hồi tạo máu 174
3.2. Tạo máu sau khi mọc ghép 184
3.3. Các chỉ số miễn dịch sau ghép PBSC của bệnh nhân MM 187
4. Kết quả phục hồi máu và miễn dịch của bệnh nhân NHL sau ghép 189
Nhánh 6 191
1. Kết quả chung của nghiên cứu 191
1.1. Một số đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu 191
1.2. Về tính khả thi của kỹ thuật 192
1.3. Về chất lượng hỗn hợp tế bào gốc thu được 192
1.4. Về các thông số theo dõi sau thủ thuật 193
2. Kết quả dựa trên những thay đổi lâm sàng và cận lâm sàng 194
2.1. Biến đổi trên lâm sàng 194
2.2. Những kết quả đánh giá cận lâm sàng 195
3. Các xét nghiệm đánh giá huyết học và miễn dịch 199
3.1. Các xét nghiệm huyết học 199
3.2. Các xét nghiệm miễn dịch 200
Kết luận 201
Khuyến nghị 202
Tài liệu tham khảo
MỞ ĐẦU
Tế bào gốc là các tế bào chưa biệt hóa, có khả năng tự làm mới và duy trì kiểu hình “gốc” trong suốt quá trình tồn tại của cá thể. Chúng là những tế bào có khả năng biệt hóa cao. Tùy theo nguồn gốc, chúng có khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào với từng điều kiện nuôi cấy riêng biệt. Nhờ những đặc tính đặc biệt này, tế bào gốc trở thành ứng cử viên sáng giá trong việc cung cấp nguồn tế bào cho điều trị. Các tế bào gốc được cấy ghép trên các bệnh nhân có các bệnh lí do sự thiếu hụt hoặc giảm chức năng của dòng tế bào nào đó với mục đích tái tạo hoặc phục hồi một phần các chức năng này. Hiện nay, nhiều mô hình nghiên cứu trên động vật thực nghiệm, sử dụng tế bào gốc trong một số bệnh lý tim mạch, bệnh hệ thống tạo máu, bệnh tiểu đường và bệnh thuộc hệ thần kinh đã có hiệu quả khả quan. Những phương pháp này đã và đang bước đầu được ứng dụng điều trị trên người. Bí quyết then chốt đảm bảo cho sự thành công và bền vững của hướng điều trị này là công nghệ tế bào, trong đó công nghệ phân lập, nuôi cấy, bảo quản dài ngày và nghiên cứu tìm ra các điều kiện biệt hóa chuyên biệt tế bào gốc. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells, MSCs) có thể được phân lập từ nhiều mô trong cơ thể trưởng thành như tủy xương, mô mỡ, thành mạch máu, máu cuống rốn . [1, 2], có khả năng biệt hóa tạo thành các tế bào thuộc ba lá phôi, như dòng trung bì phôi (nguyên bào xương, tế bào mỡ, tế bào sụn), dòng ngoại bì phôi (tế bào thần kinh) và dòng nội bì phôi (tế bào gan, tế bào tụy) [3]. Nghiên cứu và sử dụng MSC không vấp phải các rào cản về đạo đức trong Y học như nghiên cứu trên tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cells, ESC). Việc ứng dụng MSC trong lĩnh vực Y học nhằm tái tạo, sửa chữa các mô bị tổn thương hay khiếm khuyết có tính khả thi cao do MSC được nhân nuôi dễ dàng ngoài cơ thể và vẫn giữ được các đặc tính của tế bào gốc. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây các nghiên cứu về tế bào gốc trung mô mới thực sự được triển khai tại một số trung tâm nghiên cứu lớn, trong đó có trường Đại học Y Hà Nội.
Từ tháng 7 năm 2007, chúng tôi đã thực hiện đề tài cấp Nhà nước với tên đề tài: Nghiên cứu phát triển và ứng dụng công nghệ tế bào gốc để điều trị một số bệnh về tim mạch, cơ quan tạo máu và thị giác ở người.
với mục tiêu chung và mục tiêu cụ thể như sau.
1. Mục tiêu chung
- Xây dựng thành công quy trình công nghệ phân lập, nuôi cấy và bảo quản và biệt hóa một số dòng tế bào gốc từ các nguồn khác nhau.
- Bước đầu lưu giữ và bảo quản tế bào gốc và điều trị thử nghiệm một số bệnh trên người.
2. Mục tiêu cụ thể
2.1. Xây dựng quy trình công nghệ nhận biết, phân lập, nuôi cấy và bảo quản dài ngày một số dòng tế bào gốc từ các nguồn gốc khác nhau.
2.2. Bước đầu nghiên cứu thăm dò các điều kiện nuôi cấy biệt hóa tế bào gốc thành một số dòng tế bào chuyên biệt của hệ tim mạch.
2.3. Thiết lập mô hình động vật thực nghiệm ứng dụng tế bào gốc trong điều trị một số bệnh lý cơ quan tạo máu, bệnh lý giác mạc, xây dựng các tiêu chuẩn đánh giá về hiệu quả điều trị.
2.4. Bước đầu tiến hành điều trị thử nghiệm một số loại hình bệnh lý trên người, đánh giá hiệu quả điều trị.
2.5. Xây dựng quy trình chuẩn cho việc lưu giữ và bảo quản tế bào gốc người (3-5 dòng tế bào) từ các nguồn gốc khác nhau.