Tiến Sĩ Nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân wilson

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
NĂM 2015
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson . 3
1.2. Sinh lý bệnh Wilson . 4
1.3. Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh Wilson 7
1.3.1. Triệu chứng lâm sàng ở giai đoạn đầu 7
1.3.2. Triệu chứng lâm sàng ở giai đoạn toàn phát . 8
1.3.3. Các thể lâm sàng . 11
1.3.4. Các chỉ số cận lâm sàng 11
1.4. Chẩn đoán bệnh 13
1.4.1. Chẩn đoán xác định . 13
1.4.2. Chẩn đoán phân biệt 13
1.5. Di truyền học bệnh Wilson 14
1.6. Điều trị bệnh Wilson 15
1.6.1. Chế độ ăn uống 16
1.6.2. Thuốc điều trị bệnh Wilson . 16
1.7. Phòng bệnh và tiên lượng bệnh Wilson . 17
1.8. Cơ chế bệnh sinh và các dạng đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson . 18
1.8.1. Vị trí, cấu trúc của gen ATP7B . 18
1.8.2. Một số đột biến gen ATP7B hay gặp gây bệnh Wilson 20
1.8.3. Cơ chế bệnh sinh bệnh Wilson 24
1.9. Các kỹ thuật phát hiện đột biến gen ATP7B 24
1.9.1. Kỹ thuật PCR 24
1.9.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp biến tính . 26
1.9.3. Phân tích cấu trúc đa hình thái chuỗi đơn . 29
1.9.4. Sử dụng enzym cắt giới hạn 32
1.9.5. Kỹ thuật giải trình tự gen 32
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 36
2.1. Đối tượng nghiên cứu 36
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu . 36
2.2.1. Hóa chất 36
2.2.2. Trang thiết bị máy móc . 38
2.3. Phương pháp nghiên cứu 39
2.3.1. Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi 39
2.3.2. Kỹ thuật PCR khuếch đại 21 exon của gen ATP7B . 41
2.3.3. Giải trình tự gen 44
2.3.4. Phương pháp phân tích kết quả . 46
2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 47
2.5. Quy trình nghiên cứu . 48
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49
3.1. Phát hiện đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson . 49
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA 49
3.1.2. Kết quả chạy PCR khuếch đại các exon của gen ATP7B . 50
3.1.3. Kết quả xác định đột biến điểm bằng kỹ thuật giải trình tự gen . 51
3.2. Thiết lập bản đồ đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson ở Việt Nam . 63
Chương 4: BÀN LUẬN . 70
KẾT QUẢ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN ATP7B . 71
Bệnh nhân có đột biến sai nghĩa . 75
Bệnh nhân có đột biến sai nghĩa dị hợp tử . 75
Bệnh nhân có đột biến sai nghĩa đồng hợp tử . 76
Bệnh nhân có đột biến ở vùng 5’ UTR . 77
Bệnh nhân có đột biến tạo mã kết thúc sớm . 78 Bệnh nhân có đột biến thêm nucleotid 79
Bệnh nhân với những đột biến kết hợp trên gen ATP7B 80
Bệnh nhân có 2 đột biến dị hợp tử 80
Bệnh nhân có đột biến dị hợp tử kết hợp với đồng hợp tử . 81
Bệnh nhân có 2 đột biến đồng hợp tử . 83
Bệnh nhân có kết hợp nhiều đột biến trên gen ATP7B 83
KẾT QUẢ THIẾT LẬP BẢN ĐỒ GEN GÂY BỆNH WILSON 90
KẾT LUẬN 92
KIẾN NGHỊ . 93
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh Wilson được mô tả lần đầu tiên vào cuối thế kỷ 19 và cho đến nay
bệnh đã được phát hiện khá rộng rãi ở hầu hết quốc gia và chủng tộc trên thế
giới. Tần suất mắc bệnh vào khoảng ~ 1/350 trẻ sinh ra [1],[2]. Theo tỷ lệ
này, ước lượng ở nước ta hiện nay có khoảng 3000 người mắc bệnh Wilson.
Đây là một bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể số 13, gây nên bởi đột biến
gen ATP7B. Gen này có vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa sự hấp
thu, phân phối và thải trừ đồng của cơ thể. Do đó khi đột biến gen, sẽ gây rối
loạn quá trình chuyển hóa đồng, giảm bài xuất đồng qua đường mật, lượng
đồng ứ đọng dần trong các tổ chức như: Gan, não, mắt, da, thận, xương,
khớp . và gây ra các triệu chứng đa dạng trên lâm sàng, các triệu chứng này



tiến triển nặng dần cùng với quá trình lắng đọng đồng theo thời gian [3]. Ở
điều kiện sinh lý bình thường, lượng đồng được đưa vào cơ thể từ 2mg đến
5mg/ngày. Sau khi được hấp thụ tại ruột non, đồng được đưa vào huyết tương
và gắn với Albumin dưới dạng Cu2+ trước khi kết hợp với các protein khác
của gan để tổng hợp thành ceruloplasmin hoặc đào thải qua mật [4],[5]. Quá
trình tạo thành ceruloplasmin hoặc bài tiết đồng qua đường mật bị suy giảm
trong bệnh Wilson. Ban đầu đồng sẽ tích lũy tại gan gây tổn thương tế bào
gan (do 80% lượng đồng được dự trữ trong gan). Sau đó lượng đồng dư thừa
sẽ được vận chuyển theo hệ tuần hoàn đến cơ quan đích: Não, mắt, thận, da,
xương, khớp . và tích tụ, gây tổn thương nghiêm trọng chức năng các cơ quan
này. Bệnh nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời sẽ tiến triển nhanh
sang giai đoạn toàn phát với nhiều biến chứng về thần kinh, tiêu hóa, tâm
thần, rối loạn sắc tố và các rối loạn khác [6],[7],[8].
Ở Việt Nam, lần đầu tiên vào năm 1969, Bùi Quốc Hương và cộng sự đã
báo cáo 8 trường hợp bệnh Wilson tại hội nghị Thần kinh học quốc tế lần thứ
IX tại Mỹ [9]. Sau đó vào những năm 2002-2005 Thái Duy Thành và cộng sự
đã có công trình nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 29
trường hợp bệnh nhân Wilson ở khoa Thần kinh - bệnh viện Bạch Mai [1].
Tiếp theo Quách Nguyễn Thu Thủy và cộng sự công bố nghiên cứu về đặc
điểm lâm sàng bệnh Wilson ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương giai đoạn
2001 - 2006 [2]. Tuy nhiên, cho đến nay ở Việt Nam gần như chưa có một
công trình nghiên cứu toàn diện nào về phát hiện đột biến gen gây bệnh
Wilson. Việc xác định chính xác các đột biến trên gen ATP7B ở bệnh nhân
Wilson sẽ giúp xác định nguyên nhân gây bệnh, đồng thời tạo tiền đề quan
trọng cho việc phát hiện người lành mang gen bệnh trong dòng họ có cùng
quan hệ huyết thống với bệnh nhân và tư vấn trước hôn nhân, giúp ngăn ngừa
và giảm tỷ lệ mắc bệnh. Từ thực tế trên, đề tài "Nghiên cứu phát hiện đột
biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson" được thực hiện với mục tiêu:
1. Phát hiện đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson.
2. Thiết lập bản đồ đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson trên bệnh nhân
Wilson Việt Nam.