Thạc Sĩ Nghiên Cứu Phân Loại, Khả Năng Phân Hủy Ddt Và Sinh Laccase Của Chủng Nấm Sợi Phân Lập Từ Đất Ô Nhiễ

MỤC LỤC
MỤC LỤC 1
MỞ ĐẦU 4
PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6
1 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA DDT 6
1.1 Cấu trúc của DDT 6
1.2 Tính chất lý hóa của DDT 6
2 ẢNH HƯỚNG ĐẾN MÔI TRƯỜNG VÀ SỨC KHỎE CON NGƯỜI
CỦA DDT 7
2.1 Ảnh hưởng đến môi trường 7
2.2 Ảnh hưởng đến sức khỏe con người 9
3 TÌNH TRẠNG Ô NHIỄM DDT 11
3.1 Nguồn gốc phát sinh 11
3.2 Tình trạng ô nhiễm DDT trên thế giới 13
3.3 Tình trạng ô nhiễm DDT ở Việt Nam 14
4 CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ Ô NHIỄM DDT 16
4.1 Các phương pháp cơ, hóa lý 16
4.1.1 Phương pháp chôn lấp, cô lập 16
4.1.2 Phương pháp đốt có xúc tác 17
4.1.3 Phương pháp phân hủy bằng kiềm nóng 17
4.2 Phương pháp phân hủy sinh học 18
5 PHÂN HỦY SINH HỌC DDT 20
5.1 Khả năng phân hủy DDT bởi vi sinh vật 20
5.1.1 Loại clo bởi quá trình khử 21
5.1.2 Khoáng hoá DDT bởi nấm thủy phân lignin 22
5.1.3 Phân hủy DDT bởi vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí 23
5.2 Các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến phân hủy sinh học DDT và
các dẫn xuất của DDT 26
6 LACCASE 27
6.1 Định nghĩa 27
6.2 Cấu trúc phân tử của laccase 28
6.3 Cơ chế xúc tác của laccase 30
6.4 Tính chất hóa sinh của laccase 32
6.5 Sự phân bố và một số vi sinh vật sinh laccase 33
6.6 Gene mã hóa laccase 34
6.7 Ứng dụng của laccase 36
6.8 Lignin peroxidase và Mangan peroxidase 37
6.8.1 Lignin peroxidase 37
6.8.2. Mangan peroxidase 38
7 PHÂN LOẠI VI SINH VẬT 39
7.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 39
7.2 Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gene mã hóa 18S Rrna 39
7.2.1 Một số phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 39
7.2.2 Phân loại dựa vào trình tự gene mã hoá 18S rRNA 40
PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42
1 VẬT LIỆU 42
1.1 Nguyên liệu 42
1.2 Hóa chất 42
1.3 Thiết bị 42
1.4. Môi trường nuôi cấy 43
2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45
2.1 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm sợi 45
2.2 Sàng lọc khả năng sinh Lac, LiP, MnP 45
2.3 Nghiên cứu khả năng phân hủy DDT của chủng FNA1 45
2.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 46
2.4.1 Xác định hoạt tính laccase 46
2.4.2 Xác định hoạt tính LiP 47
2.4.3 Xác định hoạt tính MnP 47
2.5 Khảo sát các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng phát triển và sinh laccase của chủng FNA1 48
2.6 Xác định một số tính chất hóa sinh của laccase thô 49
2.7 Phân loại nấm sợi dựa vào xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 18S rRNA 50
2.7.1 Tách DNA tổng số từ nấm sợi 50
2.7.2 Nhân đoạn gen bằng kỹ thuật PCR 51
2.7.3 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ và biến nạp vào E.coli 53
2.7.4 Tách chiết DNA plasmid 53
2.7.5 Kiểm tra plasmit mang sản phẩm PCR mong muốn 54
2.7.6 Điện di kiểm tra DNA tổng số 55
2.6.8 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 55
2.6.7 Xác định trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA 55
PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56
1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC VÀ CUỐNG SINH
BÀO TỬ CỦA CÁC CHỦNG FNA1, FNA2, FNA3 56
2 SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP Lac, LiP, MnP 57
3 KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT CỦA CHỦNG FNA1 59
4 CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP LACCASE CỦA CHỦNG FNA1 64
4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy, nồng độ NaCl 64
4.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 64
4.1.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 65
4.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl 67
4.2 Ảnh hưởng của nồng độ DDT và nồng độ glucose 68
4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ DDT 68
4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ glucose 69
4.3 Ảnh hưởng của các chất cảm ứng 71
4.3.1 Guaiacol, veratyl alcohol, CuSO 71
4.3.2 Các chất ô nhiễm khác 72
4.4 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt 74
4.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitơ và môi trường thay thế 76
4.5.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon 76
4.5.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 78
4.5.3 Ảnh hưởng của môi trường thay thế 80
5 MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA LACCASE THÔ 81
5.1 pH tối ưu và độ bền pH 81
5.1.1 pH tối ưu 81
5.1.2 Độ bền pH 83
5.2 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase và độ bền nhiệt 84
5.2.1 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase 84
5.2.2 Độ bền nhiệt 85
6 PHÂN LOẠI CHỦNG NẤM SỢI FNA1 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO
SÁNH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MÃ HÓA 18S rRNA 86
6.1 Tách chiết DNA tổng số 86
6.2 Nhân đoạn gen 18S rRNA bằng kỹ thuật PCR 87
6.3 Tách dòng gen 18S rRNA trong vectơ pTZ57R/T 88
6.4 So sánh trình tự đoạn gen mã hóa 18S rRNA của chủng FNA1 91
KẾT LUẬN 94
MỞ ĐẦU
DDT (Dichloro - Trichloroethane Diphenyl) là một trong những thuốc
trừ sâu tổng hợp được biết đến nhiều nhất. DDT được tổng hợp đầu tiên vào
năm 1874, nhưng thuộc tính thuốc trừ sâu của DDT thì cho đến 1939 mới
được khám phá. Vào những năm đầu của Chiến tranh Thế giới thứ II, DDT
được sử dụng với lượng lớn để kiểm soát muỗi truyền bệnh sốt rét, bệnh sốt
phát ban, và các bệnh do côn trùng khác trong cả quân đội lẫn dân cư. DDT
trở thành loại thuốc trừ sâu phổ biến sử dụng trong nông nghiệp. Chúng có
mặt ở khắp mọi nơi, trong không khí, đất, nước do một lượng lớn đã được giả i
phóng ra khi phun trên các cánh đồng và rừng để diệt muỗi và côn trùng.
Ngày nay DDT đã bị cấm sử dụng do tính độc của nó như có khả năng
gây ung thư tiềm tàng, gây đột biến và gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng.
Để bảo vệ môi trường và sức khỏe con người, cần phải xử lý khử độc DDT
trong môi trường đất cũng như trong các môi trường khác. DDT ở trong đất
có thể giảm đi do sự bay hơi, sự xói mòn đất, sự hấp thu của động vật, thực
vật và sự phân hủy sinh học của các vi sinh vật có sẵn trong đất nhưng với
thời gian tương đối lâu.
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đã có một số phương pháp khử độc
khác nhau được nghiên cứu và áp dụng. Trong đó phương pháp xử lý sinh học
nhờ các vi sinh vật và hệ enzyme do chúng tiết ra là một hướng đi mới có
nhiều triển vọng. Hệ enzyme sử dụng trong xử lý sinh học chủ yếu là các
enzyme ngoại bào, chúng có khả năng phá vỡ các liên kết trong các hợp chất
hữu cơ hoặc xúc tác chuyển hóa chúng thành các chất ít độc hơn và các dạng
dễ bị phân hủy hơn. Nhóm enzyme có vai trò lớn trong quá trình phân hủy
DDT cũng như các chất thuộc POPs khác gồm có laccase (Lac), mangan
peroxidase (MnP) và lignin peroxidase (LiP), trong đó laccase có vai trò quan
trọng và đang bắt đầu được quan tâm nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam.
Tại Nhóm nghiên cứu Công nghệ sinh học xử lý khử độc các chất ô
nhiễm hữu cơ khó phân hủy (Persistent Organic Pollutants – POPs), phòng
Công nghệ Sinh học Môi trường, Viện CNSH, Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam đã có những nghiên cứu bước đầu về khả năng phân hủy DDT,
DDD, DDE và sinh enzyme ngoại bào Lac, MnP, LiP [4,5,6]. Để làm rõ bả n
chất sinh học và khả năng sinh enzyme của các chủng nấ m sợi phân lập từ đất
ô nhiễm DDT phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng enzyme ngoại bào vào
xử lý các chất ô nhiễm khó phân hủy POPs, chúng tôi đã thực hiện đề tài với
tên là: “Nghiên cứu phân loại, khả năng phân hủy DDT và sinh laccase
của chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu”.
Nội dung bao gồm:
1. Phân loại và định tên chủng nấm sợi dựa vào đặc điểm hình thái và
trình tự đoạn gene mã hoá 18S rRNA.
2. Nghiên cứu khả năng phân hủy DDT của chủng nấ m sợi FNA1.
3. Nghiên cứu khả năng sinh laccase của chủng nấm sợi FNA1.