Thạc Sĩ Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính chitinase tại thành phố Buôn Ma Th

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Chitinase là enzyme thủy phân chitin, có vai trò quan trọng trong sản xuất
các sản phẩm từ chitin như N-acetyl-D-glucosamine, Oligo N-acetyl-D-
glucosamine, glucosamine. Oligo N-acetyl-D-glucosamine được biết đến như
một loại thuốc quý, một loại thuốc đa hiệu quan trọng trong y học, là nguyên liệu
điều chế một số dược phẩm quý chữa trị các bệnh: viêm khớp, bệnh viêm phổi,
viêm sưng dạ dày, chống nhiễm trùng Ngoài ra, Oligo N-acetyl-D-
glucosamine còn có khả năng chống khối u, kháng nấm và kháng vi khuẩn.
Chính vì vậy, nghiên cứu về chitinase là vấn đề đã và đang được quan tâm nhiều
của các nhà khoa học từ trước đến nay.
Enzyme chitinase có thể được tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau như
động vật, thực vật và vi sinh vật. Quy trình thu nhận chitinase từ động vật, thực
vật khá phức tạp, không thể tiến hành tự động hóa, giá thành chế phẩm cao và
cũng không thể đáp ứng nhu cầu thực tế. Trong khi đó vi sinh vật có thể nói là
nguồn quý giá và vô tận để thu nhận enzyme chitinase.
Đặc biệt cùng với xu hướng phát triển một nền nông nghiệp sạch, bền
vững thì các loại phân bón - thuốc bảo vệ thực vật hữu cơ hoặc có nguồn gốc
sinh học đang được đề cao nghiên cứu và phát triển. Những nhóm vi sinh vật có
khả năng tạo chitinase rất được quan tâm. Chúng vừa có khả năng phân giải
nguồn chitin tự nhiên bổ sung dinh dưỡng cho cây trồng; vừa có tính đối kháng
với các loài nấm gây bệnh cây trồng, gây mục gỗ, nhờ hoạt chất kháng sinh và
đặc biệt là hệ enzyme thủy phân, trong đó có chitinase.
Như vậy, việc nghiên cứu các đối tượng vi sinh vật có khả năng tạo
chitinase có hoạt tính cao là một bước đi hữu ích trong nghiên cứu, sản xuất và
ứng dụng chitinase trong đời sống. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài “Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt
tính chitinase tại thành phố Buôn Ma Thuột”. 2
2. Mục tiêu đề tài
1. Tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn có khả năng tạo chitinase cao.
2. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến việc sản sinh và hoạt tính enzyme
chitinase từ các chủng xạ khuẩn tuyển chọn.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học
+ Khai thác và bảo tồn nguồn gen quí của một nhóm vi sinh vật có khả năng
phân giải chitin, hợp chất phức tạp thành những chất đơn giản, dễ sử dụng cho
các đối tượng sinh vật hay phục vụ nghiên cứu khoa học.
- Ý nghĩa thực tiễn
+ Góp phần khai thác tiềm năng ứng dụng của các chủng xạ khuẩn trên hệ
thống canh tác ở Đắk Lắk.3
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Enzyme vi sinh vật
Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác. Các enzyme xúc tác cho hầu hết
các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình
chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng cân đối,
theo những hướng xác định. Như vậy, enzyme đảm bảo cho sự trao đổi thường
xuyên giữa cơ thể sống và môi trường ngoài, nghĩa là bảo đảm điều kiện tiên
quyết cho sự tồn tại của cơ thể sống.
Enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Sau khi
được tổng hợp enzyme có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch của cơ
thể, dịch môi trường được gọi là enzyme ngoại bào (extracellular enzyme) hoặc giữ
lại bên trong tế bào gọi là enzyme nội bào (intracellular enzyme). Sự phân bố
enzyme không đồng đều giữa các loài, các tế bào mô và cơ quan khác nhau.
Trong các nguồn nguyên liệu để tách enzyme, vi sinh vật là nguồn nguyên
liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp.
Dùng vi sinh vật để thu nhận enzyme có những lợi ích chính như sau:
- Có thể chủ động về nguồn nguyên liệu.
- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, khoảng 16 - 100 giờ. Do đó có
thể thu hoạch hàng trăm lần trong một năm.
- Điều khiển sự tổng hợp enzyme để tăng lượng enzyme được tổng hợp
hoặc tổng hợp định hướng enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác.
- Giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn giản rẻ tiền.
Tuy nhiên, điều đáng lưu ý là một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố,
vì vậy cần có biện pháp xử lý thích hợp.
Khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật chịu sự tác động của nhiều yếu
tố khác nhau, trong đó đặc điểm chủng giống có tính quyết định. Ngoài ra, điều
kiện môi trường, trước hết là thành phần môi trường nuôi cấy cũng có vai trò
đáng kể. 4
Để lựa chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme mạnh có thể
tiến hành phân lập từ môi trường tự nhiên, gây đột biến các chủng đã được lựa
chọn hoặc cấy chuyển gen để nâng cao khả năng thu nhận enzyme hoặc tổng hợp
enzyme có định hướng.
Môi trường dinh dưỡng phải đảm bảo những nhu cầu tối thiểu cho sự sinh
trưởng của vi sinh vật và sinh tổng hợp enzyme. Trong môi trường cần có các
chất chứa C, N, H, O và các chất vô cơ khác như mangan, canxi, fotfo, lưu
huỳnh, sắt, kali và một số chất khác [2], [16].
1.2. Đại cương về chitinase
Chitinase hay poly β-1,4 (2-acetamido-2-deoxy) - D - glucozid
glucanohydrolase, thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy
phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết
1,4 β-glucoside trong chitin. Mã số của chitinase EC 3.2.1.14 [23]. Chitinase
thuộc lớp 3 tổ 2 nhóm 1 số thứ tự là 14.
1.2.1. Phân loại chitinase
1.2.1.1. Phân loại theo phản ứng cắt
Chitinase được chia làm 2 phân nhóm chính:
- Endochitinase (EC 3.2.1.14) là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin
một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide.
- Exo chitinase được chia làm 2 phân nhóm:
+ Chitobiosidase = chitobiase (EC 3.2.1.29) xúc tác sự tạo thành liên tục
Diacetylchitibiose của sợi chitin.
+ β-1,4-N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.30) tiếp tục phân cắt các
oligomer trên thành N-acetyl-D-glucosamine [24].
1.2.1.2. Phân loại theo cấu trúc phân tử
Chitinase được xếp vào hai họ Glycohydrolase:
- Họ Glycohydrolase 18 5
Là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi được tìm thấy ở hầu hết các
loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và Virus. Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase,
ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-
acetylglucosaminidase.
Các chitinase thuộc họ glycohydrolase 18 được tổng hợp từ Aeromonas
hydrophila, Bacillus circularis, Tricoderma harzianum, Aphanocladium album,
Serratia marcescens
Chitinase họ glycohdrolase 18 giữ nguyên cấu hình anomer tại vị trí phân
cắt nhờ cơ chế nghịch chuyển đôi. Đến nay cấu trúc không gian ba chiều của một
vài enzyme thuộc họ này đã được xác định như chitinase A của Serratia
marcescens, chitinase của Hevea brasiliensis, β-N-acetylglucosaminidase của
Flavobacterium menigoseptium và Streptomyces plicatus. Mặc dù ba protein này
ít tương đồng với nhau về trình tự axit amin nhưng chúng đều có cấu trúc xác
định gồm 8 sợi xoắn α và β cuộn tròn.
- Họ Glycohydrolase 19
Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có
ở các xạ khuẩn như Streptomyces griceus, vi khuẩn như Haemophilus
influenzae
Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II, IV,
Chitnase thuộc họ 19 có cấu trúc hình cầu với các vòng α thông qua cơ
chế nghịch chuyển cấu hình anomer tại vị trí phân cắt. Đây là điểm khác biệt
chính so với họ Glycohydrolase 18 [24].
1.2.1.3. Phân loại theo trình tự amino axit
Dựa vào trình tự đầu amin, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptit
nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại chitinase thành 5 nhóm:
- Nhóm I: gồm những đồng phân trong phân tử có đầu N giàu cystein nối
với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu cacboxyl C
(peptit nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết
enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt tính xúc tác. Nhóm 1 còn có 6
thể chia thành 2 nhóm: Ia hoặc Ib tùy thuộc vào enzyme thuộc tính axit hay
bazơ. Chitinase có ở thực vật thường định vị ở vị trí không bào.
- Nhóm II: gồm những đồng phân trong phân tử chỉ có tâm xúc tác thiếu
đầu cystein ở đầu N và peptit nhận biết ở đầu C, có trình tự amino axit tương tự
như trình tự chitinase nhóm I. Chitinase nhóm II có ở xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm,
thực vật và chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài.
- Nhóm III: có trình tự amino axit hoàn toàn khác với trình tự amino axit ở
nhóm I và nhóm II.
- Nhóm IV: gồm những đồng phân chitinase, 41% - 47% trình tự amino
axit có ở tâm xúc tác của chúng giống với trình tự chủ yếu có ở cây 2 lá mầm,
amino axit ở nhóm I. Phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân
tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase ở nhóm I.
- Nhóm V: Dựa trên cơ sở dữ liệu về trình tự người ta nhận thấy vùng gắn
với chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa
gặp ở thực vật bậc cao.
1.2.2. Cấu trúc của chitinase
1.2.2.1. Cấu trúc phân tử
Nhiều enzyme phân cắt carbonhydrat được phát hiện có cấu trúc chia
vùng tương tự nhau. Blaak và cộng sự [21] tiến hành phân tích chitinase của thực
vật, nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và đã xác định được những vùng riêng biệt trong
cấu trúc của chitinase. Các chitinase của thực vật như: cây thuốc lá, đậu, củ cải
đường .chỉ chứa duy nhất một trung tâm xúc tác. Chitinase của nấm men bao
gồm 4 vùng: trình tự báo hiệu, trung tâm xúc tác, vùng giàu serin/ threonin và
trung tâm gắn chitin ở đầu C. Vùng giàu serin/ threonin hoạt tính như một chất
nhận tham gia trong sự glycosyl hóa nguyên tử oxy.
Bên cạnh đó Wantanabe và cộng sự [20] ghi nhận loài Bacillus circulans
có chitinase A1 chứa tâm gắn chitin ở đầu C, tâm xúc tác ở đầu N và một vùng
chức năng thứ ba là vùng fipronectin kiểu III, nếu loại bỏ vùng này thì không 7
ảnh hưởng đến sự gắn kết enzyme và cơ chất nhưng khả năng xúc tác của
enzyme thì bị giảm đi.
1.2.2.2. Cấu trúc không gian của chitinase
- Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18
Tâm của chitinase thuộc họ này tạo thành từ 8 thùy tròn α và β. Thùy số 8
cuộn vào bên trong cấu hình nhộng với vòng xoắn thể hiện như một chiếc nhẫn
hướng ra ngoài.
Hình 1.1. Mô hình cấu trúc không gian của chitinase ở
cây cao su Hevea brasiliensis
- Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19
Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ này là phức hợp của cấu trúc
bậc 2, bao gồm 10 đoạn helical và 1 phiến β ba sợi. Phân tích protein cho thấy có
nhiều nhóm tương tác kỵ nước bảo vệ tâm protein của cấu trúc bậc 3 [24].
1.2.3. Cơ chế tác dụng của chitinase
Chitinase xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết 1,4-β-glycozid trong
phân tử chitin, phân cắt dọc theo mạch carbon và sản phẩm chủ yếu là chitibiose
và chitotriose. Những chất này sau đó lại tiếp tục bị phân cắt thành những
monomer là các N -acetyl -D -glucosamine [29].
Quá trình phân cắt tóm tắt như sau:
Chitinase Chitobiase
Chitin -----------
chitobiose,chitotriose --------
N-acetyl-D glucosamin 8
Có hai cơ chế cho sự thuỷ phân: cơ chế giữ lại cấu tử β anomer trong sản
phẩm và cơ chế nghịch chuyển từ dạng β sang dạng α.
Ngoài ra để khảo sát sự phân cắt người ta sử dụng N-acetyl
chitoolygosaccharide thường được thuỷ phân bên trong trên một vài vị trí xác
định hoặc một cách ngẫu nhiên.
1.2.4. Đặc tính cơ bản của hệ chitinase
- Khối lượng phân tử
Chitinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao hoặc tảo biển có trọng lượng
phân tử khoảng 30 kDa. Ở các loài thân mềm, động vật có xương, trọng lượng
phân tử của chitinase khoảng 40-90 kDa, hoặc cao hơn khoảng 120 kDa. Trọng
lượng phân tử của chitinase thu nhận từ xạ khuẩn và vi khuẩn có khoảng biến
động từ 30-120 kDa [24].
- Điểm đẳng điện
Chitinase ở thực vật bậc cao và tảo có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi từ
3,0-10,0. Ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá pI từ 4.7-9.3 và ở vi sinh vật từ
3,5-8,8 [29].
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ tối ưu cho hệ chitinase ở hầu hết vi sinh vật là 40 0 C. Ngoại trừ
Aspergilus niger có khả năng tổng hợp chitinase hoạt động trên cơ chất
glycochitin có nhiệt độ tối ưu là 50 0 C [29].
Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà chitinase có thể có những gi