Tiến Sĩ Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea L.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2013

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Một trong những hiện tượng thay đổi của môi trường ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của thực vật là tình trạng hạn. Hạn hán có ảnh hưởng xấu ở các mức độ khác nhau trong suốt quá trình hay từng giai đoạn sống của cơ thể thực vật dẫn đến làm giảm năng suất cây trồng, chậm phát triển và gây chết. Hiện nay trên thế giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán. Tại Việt Nam trong 7,3 – 7,4 triệu ha đất trồng thì có tới 1,5 – 1,8 triệu ha bị thiếu nước.
Nghiên cứu bản chất tính chống chịu của cây trồng cho thấy đây là một tính trạng đa gen. Vai trò cụ thể của từng gen riêng rẽ liên quan đến tính chống chịu ở thực vật (ví dụ P5CS, RD22 ) đã được nhiều nghiên cứu tìm hiểu và phân tích. Tuy nhiên, dưới tác động của các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh, không chỉ các gen riêng rẽ được biểu hiện mà là một hệ thống các gen liên quan được kích hoạt biểu hiện nhằm đáp ứng với tình trạng bất lợi mà thực vật gặp phải. Một trong số những yếu tố kích hoạt hoạt động của các gen liên quan đến khả năng chống chịu là các nhân tố phiên mã (transcription factor – TF).
Họ nhân tố phiên mã NAC (NAC transcription factor) là một trong những họ TF đặc trưng lớn nhất trong hệ gen thực vật [106]. Nhân tố phiên mã NAC có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý quan trọng trong cơ thể thực vật [99]. Nhiều gen NAC tham gia vào phản ứng với những áp lực khác nhau từ môi trường trong đó có hạn [87], [113], [133] Nhiều tác giả đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC thành công vào một số loài cây trồng như: cây lúa, lúa mỳ, thuốc lá, .[54], [55], [60], [77], [87], [103], [127], [133]. Trên đối tượng cây lạc, các gen AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3 liên quan đến tính chịu hạn đã được tách dòng thành công [71], AhNAC2 đã được sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc chịu hạn và chuyển thành công vào cây Arabidopsis [72].
Lạc là cây nông nghiệp ngắn ngày được trồng phổ biến trên thế giới. Ở nước ta, cây lạc được trồng trên khắp các miền và phù hợp với nhiều vùng sinh thái khác nhau. Tuy nhiên, hạn, mặn, lạnh vẫn là yếu tố hạn chế đối với sự sinh trưởng và năng suất của cây trồng trong đó có cây lạc. Cây lạc là cây họ đậu, thuộc nhóm chịu hạn kém [13]. Một số kỹ thuật chọn tạo giống có khả năng chịu hạn như lai giống
hoặc ứng dụng công nghệ tế bào thực vật đã được áp dụng [11], [13], [14], [15]. Tuy nhiên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tạo ra những giống lạc có khả năng chịu khô hạn còn chưa được nghiên cứu nhiều. Từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea L.)” nhằm thử nghiệm khả năng chuyển gen chỉ thị và tiến tới chuyển gen chịu hạn với mục đích tạo ra dòng cây chuyển gen phục vụ chọn giống chịu hạn ở cây lạc. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu nhằm cải tạo cây lạc và cải thiện về khả năng chống chịu trên đối tượng cây trồng này.

2. Mục tiêu nghiên cứu
(1) Phân lập được gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt.
(2) Thiết kế được vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2. Tạo cây chuyển gen và biểu hiện được protein NAC2 ở cây thuốc lá.
(3) Tạo được dòng cây lạc chuyển gen. Phân tích các dòng cây lạc chuyển gen. 3. Nội dung nghiên cứu
(1) Phân nhóm các giống lạc nghiên cứu theo mức độ chịu hạn thông qua đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mô sẹo và cây non.
(2) Phân lập, tách dòng và giải trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 liên quan đến tính chịu hạn của cây lạc.
(3) Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2, tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector tái tổ hợp và chuyển vào cây thuốc lá mô hình.
(4) Xác định sự có mặt của gen chuyển NAC2 trên cây thuốc lá, đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen thông qua sự thay đổi hàm lượng proline. Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp NAC2 ở cây thuốc lá chuyển gen.
(5) Phát triển hệ thống tái sinh cây ở cây lạc và chuyển gen chỉ thị (GUS) qua mô sẹo và phôi soma.
(6) Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 vào cây lạc, phân tích các dòng lạc chuyển gen.