Luận Văn Nghiên cứu phân lập tuyển chọn và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzyme β-

Nghiên cứu phân lập tuyển chọn và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzyme β- galactosidase có hiệu suất cao. Nghiên cứu phân lập tuyển chọn và tạo chủng giống sinh tổng

Bài tóm tắt
Beta-galactosidaza là enzym được sử dụng rộng rãi không chỉ trong nghiên
cứu mà còn được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, y dược. Điển hình trong
quá trình lên men bơ sữa, beta-galactosidaza được bổ sung để tránh khả năng kết
tinh lactoza và làm tăng độ ngọt của sản phẩm, trong công nghiệp dược, chúng
được sử dụng làm thuốc trợ tiêu hoá cho những người thiếu khả năng hấp thụ
lactoza và một số bệnh khác. Enzyme này rất phổ biến ở nhiều vi sinh vật và đã
được sản xuất ở mức độ công nghiệp để ứng dụng. Tuy nhiên, việc lên men những
chủng vi sinh vật này để thu enzim cũng gặp khó khăn do chủng không có khả
năng tổng hợp enzim ở mức độ cao, không có cơ chế để điều khiển sự biểu hiện
của gen mã hoá cho enzim, ngoài ra việc tinh sạch enzim cũng gặp nhiều trở ngại
do enzim bị lẫn nhiều protein của vi sinh vật chủ. Từ những khó khăn nêu trên,
chúng tôi đã đặt ra mục đích là tạo ra chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng tổng
hợp lượng lớn enzim beta-galactosidaza dưới sự điều khiển phiên mã của T7-
promotơ và enzim được tạo ra từ chủng tái tổ hợp được tinh sạch dễ dàng nhờ cột
sắc ký ái lực. Gen mã hoá cho beta-galactosidaza từ E. coli ATCC11105 được nhân
lên bằng PCR và được đưa vào vectơ biểu hiện pET22b(+) sau đó được biến nạp
vào chủng E. coli BL21. Các dòng biến nạp được chọn lọc trực tiếp trên môi trường
chứa cơ chất Xgal. Chúng tôi đã tối ưu hoá việc tổng hợp enzim từ chủng E. coli tái
tổ hợp và thu được lượng lớn enzim beta-galactosidaza. Việc tổng hợp enzim được
kiểm soát chặt chẽ dưới sự cảm ứng của IPTG. Enzim được tổng hợp từ chủng tái
tổ hợp có chứa thêm 6 axit amin Histidin. Đây là trình tự cho phép enzim được tinh
sạch một cách dễ dàng nhờ dùng cột ái lực gắn đặc hiệu với Histidin. Kết quả
chúng tôi đã tạo được chế phẩm enzim tái tổ hợp tinh sạch ở mức độ phòng thí
nghiệm.
Ngược lại với beta-galactosidaza, enzim collagenaza chỉ có mặt ở một số vi
sinh vật và động vật. Enzim này có rất nhiều ứng dụng trong y học nhờ khả năng
phân cắt các sợi collagen ở những mô hoặc da bị hỏng. Tuy nhiên việc tinh sạch
enzim này từ các chủng vi sinh vật hoặc mô động vật để ứng dụng gặp rất nhiều

khó khăn. Bên cạnh đó, gen mã hoá cho collagenaza từ vi sinh vật chưa được
nghiên cứu nhiều. Vì vậy để có thể sản xuất lượng lớn enzim từ chủng tái tổ hợp,
điều cần thiết trước tiên là phải phân lập được gen mã hoá cho enzim. Chủng
Bacillus subtilis FS-2 được biết có khả năng tổng hợp collagenza. Để phân lập
được gen, chúng tôi đã tạo ngân hàng hệ gen của chủng Bacillus trong vectơ
pUC18. Từ ngân hàng hệ gen này chúng tôi đã sàng lọc để chọn ra dòng plasmid
có chứa gen mã hoá cho collagenaza bằng cách cấy trải trên môi trường có chứa
collagen. Kết quả, trong khoảng gần 10 000 dòng biến nạp chúng tôi đã chọn được
một dòng có khả năng thuỷ phân collagen. Đoạn gen trong vectơ pUC18 này có
kích thước trên 3Kb đã được đọc trình tự và so sánh trên ngân hàng gen quốc tế để
tìm ra khung đọc đúng của gen mã hoá collagenaza.