Luận Văn Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy, bảo quản và bước đầu thăm dò khả năng biệt hóa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
Chuyên ngành : Hóa sinh Y học
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI - 2011 ​​

Luận án dài 143 trang có File WORD
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Những hiểu biết cơ bản về tế bào gốc .
1.1.1. Tế bào gốc và cách gọi tên 3
1.1.2. Những đặc điểm chung của tế bào gốc .5
1.1.3. Tế bào gốc của tủy xương . 7
1.2. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells) 10
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu 10
1.2.2. Những đặc điểm cơ bản của tế bào gốc trung mô 11
1.2.3. Khả năng biệt hóa in vitro của tế bào gốc trung mô . 16
1.2.4. Tiêu chuẩn tối thiểu của tập hợp tế bào gốc trung mô nuôi cấy . 19
1.2.5. Tiềm năng tái tạo phục hồi mô cơ tim của tế bào gốc trung mô 20
1.3. Phương pháp phân lập và điều kiện nuôi cấy tế bào gốc trung mô tủy xương người 23
1.3.1. Phân lập tế bào gốc trung mô . 23
1.3.2. Nuôi cấy tế bào gốc trung mô . 26
1.4. Liệu pháp tế bào đối với một số bệnh lý tim mạch .28
1.4.1 Những vấn đề cơ bản của liệu pháp tế bào đối với bệnh lý tim mạch. 28
1.4.2. Sự hình thành tim thời kỳ phôi thai và tín hiệu điều tiết 29
1.4.3. Hình thái học tế bào cơ tim và mô cơ tim trưởng thành . 33
1.4.4. Các thử nghiệm lâm sàng tế bào gốc trong điều trị bệnh tim mạch . 35
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 38
2.1. Đối tượng và chất liệu nghiên cứu 38
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu . 38
2.1.2. Chất liệu nghiên cứu . 38
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất 38
2.2.1. Dụng cụ . 38
2.2.2. Trang thiết bị . 38
2.2.3. Hóa chất, thuốc thử . 39
2.3. Phương pháp nghiên cứu . 40
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu 40
2.3.2. Các quy trình phân lập, nhân nuôi, bảo quản và biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xương người theo hướng dạng tế bào cơ tim . 42
2.3.3. Kỹ thuật đánh giá sự thành công của các quy trình được áp dụng . 46
2.4. Địa điểm nghiên cứu 55
2.5. Đạo đức trong nghiên cứu . 56
2.6. Xử lý số liệu . 56
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ 57
3.1. Kết quả phân lập, nuôi cấy, nhận biết và bảo quản tế bào gốc trung mô tủy xương 57
3.1.1. Tỷ lệ áp dụng thành công quy trình phân lập – nhân nuôi và quy trình bảo quản, phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung mô tủy xương người 57
3.1.2. Kết quả định danh tế bào gốc trung mô sau phân lập – nuôi cấy 57
3.1.3. Kết quả phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung mô sau bảo quản. 73
3.2. Kết quả nghiên cứu biệt hóa in vitro tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo hướng dạng tế bào cơ tim . 75
3.2.1. Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô theo trình của Tomita và cs . 75
3.2.2. Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô theo quy trình của Shim và cs 87

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 88
Phân lập, nuôi cấy, nhận biết và bảo quản tế bào gốc trung mô từ tủy xương người . 89
Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 89
Định danh tế bào gốc trung mô sau phân lập và nuôi cấy từ tủy xương người . 94
Bảo quản tế bào gốc trung mô sau phân lập và nuôi cấy từ tủy xương người 102
Biệt hóa tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo hướng dạng tế bào cơ tim . 102
Quy trình biệt hóa invitro tế bào gốc trung mô nuôi cấy theo hướng tạo dạng tế
bào cơ tim 103
Kết quả biệt hóa theo hướng dạng tế bào cơ tim 105
KẾT LUẬN 113
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ

Bảng 1.1. Phân loại một số marker bề mặt tế bào gốc trung mô 12
Bảng 1.2. Một số điều kiện nuôi cấy cơ bản tế bào gốc trung mô . 26
Bảng 1.3. Một số loại môi trường và huyết thanh được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy tế bào gốc trung mô . 27
Bảng 1.4. Thống kê các thử nghiệm lâm sàng tế bào gốc trung mô đối với bệnh tim mạch 37
Bảng 2.1. Các cặp mồi của kỹ thuật PCR . 40
Bảng 3.1. Tỷ lệ áp dụng thành công qui trình phân lập, nuôi cấy và qui trình bảo quản, phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung mô tủy xương người . 57
Bảng 3.2. Kích thước đường kính ngang của nhân tế bào nuôi cấy (n= 30) 62
Bảng 3.3. Biểu hiện marker bề mặt của tập hợp tế bào nuôi cấy, giai đoạn P1 . 71
Bảng 3.4. Mức độ biểu hiện marker bề mặt CD13, CD73, CD90 trên tập hợp tế
bào nuôi cấy, giai đoạn P1 bằng kỹ thuật FACS 71
Bảng 3.5. Kết quả so sánh mức độ biểu hiện của gen MEF2C giữa MSC không biệt hóa và MSC biệt hóa theo phương pháp của Tomita và cs, sử dụng gen tham chiếu là β-actin 86
Biểu đồ 2.1. Cường độ tín hiệu huỳnh quang phân tích biểu hiện marker bề mặt của MSC bằng kỹ thuật FACS 49
Biểu đồ 3.1. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD34 bề mặt tế bào nuôi cấy giai đoạn P0 và P1 . 63
Biểu đồ 3.2. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD34 bề mặt tế bào nuôi cấy giai đoạn P0 và P1 . 65
Biểu đồ 3.3. Các biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD13 bề mặt tế bào nuôi cấy giai đoạn P1 68
Biểu đồ 3.4. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD73 bề mặt tế bào nuôi cấy giai đoạn P0 và P1 . 69
Biểu đồ 3.5. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD90 bề mặt tế bào nuôi cấy giai đoạn P0 và P1 . 70


Sơ đồ 1.1. Phân loại tế bào gốc tương ứng theo các giai đoạn hình thành và phát triển ở người
Sơ đồ 2.1. Thiết kế nghiên cứu . 41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Sự khác biệt giữa tế bào gốc và tế bào tiền thân 6
Hình 1.2. Khả năng biệt hóa tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc trung mô trong tủy xương . 9
Hình 1.3. Khả năng đa biệt hóa in vitro tạo một số dòng tế bào chức năng của tế bào gốc trung mô 11
Hình 1.4. Nhuộm von Kossa tế bào gốc trung mô sau biệt hóa tạo nguyên bào xương (C) và đối chứng không biệt hóa (D) 17
Hình 1.5. Nhuộm Oil Red O tế bào gốc trung mô sau biệt hóa tạo tế bào mỡ (E)
và đối chứng không biệt hóa (F) . 18
Hình 1.6. Nhuộm Collagen typ II tế bào gốc trung mô sau biệt hóa tạo tế bào sụn (G) và đối chứng không biệt hóa (H) 19
Hình 1.7. Các giai đoạn mô bệnh học của bệnh nhồi máu cơ tim 29
Hình 1.8. Minh họa một số tác nhân cảm ứng và thúc đẩy quá trình hình thành tim của động vật có xương sống . 30
Hình 1.9. Hình ảnh mô cơ tim dưới kính hiển vi điện tử truyền qua . 34
Hình 2.1. Mô hình phân lớp tế bào đơn nhân tủy xương bằng kỹ thuật ly tâm theo gradient tỷ trọng 42
Hình 2.2. Dụng cụ hạ nhiệt độ bảo quản tế bào nuôi cấy . 45
Hình 2.3. Mô hình nguyên lý tạo dòng của thiết bị đếm tế bào dòng chảy 47
Hình 2.4. Mô hình khuyếch đại tín hiệu phát hiện bằng phức hệ Enzym - Strepavidin - Biotin trong nhuộm hóa miễn dịch tế bào 50
Hình 3.1. Hình ảnh tế bào bám dính và phát triển trên bề mặt nhựa nuôi cấy, ngày thứ 15, giai đoạn P0, HE x 100 58
Hình 3.2. Hình ảnh tế bào bám dính và phát triển trên bề mặt nhựa nuôi cấy, ngày thứ 20, giai đoạn P0, HE x 100 59
Hình 3.3. Hình thái và mật độ tế bào sau khi cấy chuyển ở giai đoạn nhân nuôi, HE x200 . 60
Hình 3.4. Hình ảnh tế bào nuôi cấy dạng hình sao, hình sợi. HE x100 . 61
Hình 3.5. Hình ảnh tế bào nuôi cấy dạng hình thoi. HE x 100 61
Hình 3.6. Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD34 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P1, ICC x200 . 64
Hình 3.7. Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD34 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P3, ICC x 200 64
Hình 3.8. Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD45 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P1, ICC x200 . 66
Hình 3.9. Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD45 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P3, ICC x 200 67
Hình 3.10. Tế bào nuôi cấy biệt hóa theo hướng tạo tế bào mỡ, sau biệt hóa 10 ngày, nhuộm bằng phương pháp Oil – Red – O x 100 . 72
Hình 3.11. Tế bào nuôi cấy biệt hóa theo hướng tạo tế bào mỡ, sau 10 ngày biệt hóa, nhuộm bằng phương pháp Oil – Red – O x200 73
Hình 3.12. Tế bào gốc trung mô phát triển sau bảo quản và phục hồi nuôi cấy, HE x 100 74
Hình 3.13. Hình ảnh siêu cấu trúc một phần tế bào gốc trung mô sau bảo quản - phục hồi nuôi cấy, TEM x3 000 74
Hình 3.14. Tế bào gốc trung mô không biệt hóa dưới kính hiển vi đối pha x200 . 76
Hình 3.15. Tế bào gốc trung mô biệt hóa bằng 5- azacitidine 4 tuần dưới kính hiển vi đối pha x200 77
Hình 3.16. Hình ảnh siêu cấu trúc một phần tế bào gốc trung mô không biệt hóa. TEM x2 500 . 78
Hình 3.17. Hình ảnh siêu cấu trúc một phần tế bào gốc trung mô biệt hóa theo hướng tạo tế bào cơ tim theo phương pháp của Tomita và cs 79
Hình 3.18. Hình ảnh siêu cấu trúc xơ trung gian của tế bào gốc trung mô biệt hóa sau 4 tuần theo phương pháp của Tomita và cs . 80
Hình 3.19. Nhuộm kháng thể kháng Desmin tế bào gốc trung mô biệt hóa sau 4 tuần theo phương pháp của Tomita và cs. ICC x 400 . 81
Hình 3.20. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR biểu hiện một số gen đặc trưng tế bào cơ tim của tế bào gốc trung mô biệt hóa sau 4 tuần theo phương pháp của Tomita và cs 82
Hình 3.21. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR biểu hiện gen MEF2C của tế bào gốc trung mô biệt hóa sau 2 - 4 tuần theo phương pháp của Tomita và cs 83
Hình 3.22. Hình ảnh kết quả Real-time PCR gen MEF2C của tế bào gốc trung mô không định hướng biệt hóa và sau biệt hóa 2 ư 4 tuần . 84
Hình 3.23. Hình ảnh kết quả Real-time PCR gen β - actin của tế bào gốc trung mô không định hướng biệt hóa và sau biệt hóa 2 ư 4 tuần . 85
Hình 3.24. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR biểu hiện các gen đặc trưng biệt
hóa tế bào cơ tim của MSC biệt hóa 7 ngày theo phương pháp của Shim và cs 87
Hình 4.1. Sự khác biệt về siêu cấu trúc giữa tế bào gốc trung mô không biệt hóa và tế bào gốc trung mô biệt hóa theo hướng tạo tế bào cơ tim bằng 5 – azacitidin
– TEM 106


ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, y học tái tạo (regenerative medicine) đã và đang trở thành một lĩnh vực mũi nhọn của y học hiện đại. Một trong những phương hướng của y học tái tạo là nghiên cứu việc cấy ghép mô, tế bào vào cơ thể trưởng thành nhằm phục hồi một phần hay toàn bộ chức năng của mô, tế bào sau những thương tổn bệnh lý hay lão hóa, sau những sang chấn cơ học hay do những khuyết tật bẩm sinh. Cùng với những tiến bộ về sinh học tế bào, y học tái tạo đang hướng tới các nghiên cứu nhằm khai thác tiềm năng của tế bào gốc trưởng thành đối với quá trình phục hồi của các mô có tính biệt hóa cao (thần kinh, mô cơ tim). Liệu pháp tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell) đã và đang được sử dụng trong điều trị các loại bệnh lý khác nhau, trong đó có một số bệnh tim mạch [90]. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cell - MSC) là một trong ba loại tế bào gốc trưởng thành có trong tủy xương, có khả năng biệt hóa đa dạng và những đặc tính sinh học vượt trội, đang là ứng cử viên sáng giá cho các nghiên cứu tái tạo phục hồi mô cơ tim [74],[116]. Việc sử dụng MSC trong nghiên cứu và điều trị không vi phạm pháp luật và đạo đức y học. Tuy nhiên, MSC là một quần thể tế bào gốc hiếm, tồn tại rải rác, xen kẽ trong nhiều mô với tỷ lệ rất thấp, do vậy những nghiên cứu về MSC đều được tiến hành trên các tập hợp MSC hình thành sau các quá trình phân lập, nuôi cấy ngoài cơ thể.
Từ đầu thế kỷ XX cho đến nay, bệnh tim mạch là một bệnh lý phổ biến trên thế giới, tỷ lệ mắc bệnh cao trong cộng đồng. Hàng năm tại Hoa Kỳ có khoảng 1 triệu ca nhồi máu cơ tim (NMCT) với tỷ lệ tử vong là 25% trong ba năm; có xấp xỉ 5 triệu bệnh nhân suy tim với tỷ lệ tử vong hàng năm là 20% [47]. Ở Việt Nam, số lượng bệnh nhân tim mạch cũng ngày một tăng cao do tuổi thọ được cải thiện cũng như sự gia tăng các yếu tố nguy cơ. Kỹ thuật ghép tim không chỉ hạn chế về nguồn hiến tặng, mà hiện nay vẫn tồn tại những vấn đề về kỹ thuật ghép và chi phí sau ghép. Liệu pháp tế bào trong điều trị bệnh lý cơ tim nói chung và NMCT nói riêng được cho là có thể khắc phục được cả hai vấn đề nêu trên.
Hàng loạt thử nghiệm lâm sàng đối với liệu pháp tế bào gốc tủy xương không chọn lọc, tiếp theo là liệu pháp MSC chọn lọc từ tủy xương đã được tiến hành, cho thấy tính hiệu quả và tính an toàn của các liệu pháp này đối với bệnh tim mạch.
Tại Việt Nam, sử dụng tế bào gốc của tủy xương hướng tới việc điều trị bệnh tim mạch đã được bắt đầu. Kết quả điều trị cấy ghép tế bào gốc tủy xương đầu tiên trên 6 bệnh nhân suy tim nặng sau NMCT được thực hiện tại Viện Tim mạch Quốc gia là rất đáng khích lệ [4],[6]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu phân lập nhằm tạo ra một tập hợp MSC từ tủy xương với đầy đủ các bằng chứng về tiêu chuẩn nhận biết là hết sức cần thiết, sẵn sàng cho các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng sử dụng chọn lọc MSC sau này. Các bằng chứng về khả năng biệt hóa in vitro theo hướng tạo tế bào cơ tim của tập hợp MSC nuôi cấy vừa chứng minh khả năng đa biệt hóa của MSC, vừa góp phần giải thích cơ chế tác dụng cải thiện chức năng tim thu được sau liệu pháp tế bào gốc trên 6 bệnh nhân NMCT như đã trình bày ở trên.
Mục tiêu của đề tài:
1. Áp dụng quy trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc trung mô từ tủy xương người.
2. Nghiên cứu áp dụng một số quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô thành dạng tế bào cơ tim.