Thạc Sĩ Nghiên cứu Phân lập nhóm vi khuẩn Lactic Acid có tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictal

Nghiên cứu Phân lập nhóm vi khuẩn Lactic Acid có tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Pangasianodon hypophthanlmusLỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC . i
DANH SÁCH BẢNG . v
DANH SÁCH HÌNH vii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1 Đặt vấn đề. 1
1.2 Mục tiêu đề tài 2
1.3 Nội dung đề tài 2
1.4 Phạm vi nghiên cứu đề tài 2
CHƯƠNG 2. TỔNG QUÁT TÀI LIỆU 3
2.1 Một số đặc điểm sinh học của cá Tra. 3
2.1.1 Phân loại 3
2.1.2 Phân bố. 3
2.1.3 Đặc điểm hình thái và sinh thái 3
2.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng. 3
2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng. 4
2.1.6. Đặc điểm sinh sản. 4
2.2 Các bệnh thường gặp ở Cá Tra. 4
2.2.1 Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas. 5
2.2.2 Nhiễm khuẩn do Pseudomonas (Bệnh đốm đỏ) 5
2.2.3 Nhiễm khuẩn huyết do Edwardsiella (Edwarsiellosis) 5
2.2.4 Bệnh ký sinh trùng. 6
2.3 Tình hình nuôi cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. 7
2.3.1 Tình hình nuôi cá tra. 7
2.3.2 Nghiên cứu về bệnh gan thận mủ. 8
2.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng probioic trong nuôi trồng thủy sản trên thới giới và tại Việt nam 14
2.4.1 Tình hình nghiên cứu probiotic trên thế giới 14
2.4.2 Tình hình sử dụng các chế phẩm probiotics trong hoạt động nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam 16
2.5 Ứng dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản. 19
2.5.1 Định nghĩa probiotic. 19
2.5.2 Các thành phần của probiotic. 20
2.5.3 Cơ chế tác động của pobiotic. 21
2.6 Bẻ gãy quá trình quorum sensing – cách tiếp cận mới trong việc kiểm sóat hệ vi sinh trong nuôi trồng thủy sản. 28
2.6.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing. 28
2.6.2 Sự phân hủy sinh học quá trình quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh 28
2.6.3 Những triển vọng của việc bẻ gãy quá trình quorum sensing. 31
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu. 32
3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu. 32
3.3 Phương pháp nghiên cứu. 46
3.3.1 Phương pháp thu và cố định mẫu. 46
3.3.2 Phương pháp sàng lọc vi khuẩn lactic. 48
3.3.3. Khảo sát khả năng phân hủy phân tử C6-HHL của các chủng vi khuẩn phân lập được ở điều kiện in vitro. 49
3.3.3.1. Xây dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ C6-HHL và đường kính vòng tròn sắc tố violacein. 49
3.3.3.2 Khảo sát khả năng phân hủy phân tử C6-HHL. 50
3.3.4 Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn phân lập với Edwardsiella ictaluri ở in vitro 52
3.3.4.1 Khảo sát đường cong tăng trưởng của E. ictaluri 52
3.3.4.2 Phương pháp đục lỗ trên thạch. 52
3.3.4.3 Phương pháp giếng khuếch tán (Well Diffusion method) 54
3.3.4.4 Phương pháp đĩa giấy. 56
3.3.5 Phương pháp nhuộm Gram và mô tả hình thái 57
3.4 Xử lý số liệu. 58
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn lactic acid. 59
4.3 Khảo sát đường cong tăng trưởng của E. ictaluri 60
4.4 Dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ C6-HHL và vòng tròn sắc tố 61
4.5 Kết quả kiểm tra nhanh tốc độ phân hủy HHL và khả năng đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp đục lỗ. 62
4.5.1 Khả năng phân hủy HHL của các khuẩn lạc được phân lập. 62
4.5.2 Sàng lọc nhanh khả năng đối kháng của các vi khuẩn phân lập với E. ictaluri 65
4.6 Khảo sát khả năng phân hủy C6-HHL trong điều kiện in vitro. 66
4.6.1 Nhóm vi khuẩn lactic phân lập. 66
4.6.2 Nhóm vi khuẩn từ ngân hàng vi sinh. 68
4.7 Khảo sát khả năng đối kháng của các khuẩn lạc phân lập bằng các phương pháp khác nhau. 69
4.7.1 Nhóm vi khuẩn phân lập. 69
4.7.1.1 Phương pháp đục lỗ thạch. 70
4.7.1.2 Phương pháp đĩa giấy (Disc-diffusion method) 71
4.7.1.3 Phương pháp giếng khuếch tán (Well-Diffusion method) 73
4.7.1.4 Độ nhạy của các phương pháp kiểm tra đối kháng. 75
4.7.2 Nhóm vi khuẩn từ ngân hàng vi sinh vật 77
4.8 Nhuộm gram và đặc điểm hình thái của vi khuẩn phân lập. 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO 82


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.2.1.1. Danh sách mẫu dùng phân lập vi khuẩn lactic. 32
Bảng 3.2.1.2. Danh sách các chủng vi khuẩn mua từ ngân hàng vi sinh vật (Trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội, Viện Vi Sinh và Công Nghệ Sinh Học) 36
Bảng 3.2.2.1 Thành phần môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar) 37
Bảng 3.2.2.2 Thành phần môi trường BHI (Brain Heart Infusion Broth) 38
Bảng 3.2.2.3 Thành phần môi trường MRSA (Brain Heart Infusion Agar) 38
Bảng 3.2.2.4 Thành phần môi trường MRS (Brain Heart Infusion Broth) 39
Bảng 4.1.1 Giá trị pH của dịch khuẩn trong quá trình phân lập. 60
Bảng 4.5.1.1 Kết quả sàng lọc nhanh khả năng phân hủy C6-HHL của các chủng vi khuẩn phân lập. 62
Bảng 4.5.2.1 Kết quả đối kháng của các khuẩn lạc phân lập. 66
Bảng 4.6.1.1 Phân hủy của C6-HHL của các khuẩn lạc phân lập trên cá tra và vi sinh vật trong thực phẩm lên men truyền thống trong điều kiện in vitro. 67
Bảng 4.6.2.1 Phân hủy C6-HHL của các chủng vi khuẩn từ ngân hàng vi sinh vật 68
Bảng 4.7.1.1.1. Kích thước vòng kháng khuẩn (trung bình ± sai số chuẩn, n=3) của các chủng vi khuẩn phân lập với E. ictaluri sau 24 và 48 giờ bằng phương pháp đục lỗ 70
Bảng 4.7.1.2.1. Kích thước vòng kháng khuẩn (trung bình ± sai số chuẩn, n=3) của các chủng vi khuẩn phân lập với E. ictaluri sau 24 và 48 giờ bằng phương pháp đĩa giấy 72

[TABLE]
[TR]
[TD][TABLE="width: 100%"]
[TR]
[TD]v

[/TD]
[/TR]
[/TABLE]
[/TD]
[/TR]
[/TABLE]
Bảng 4.7.1.3.1. Kích thước vòng kháng khuẩn (trung bình ± sai số chuẩn, n=3) của các chủng vi khuẩn phân lập với E. ictaluri sau 24 và 48 giờ bằng phương pháp giếng khuếch tán. 73
Bảng 3.7.1.4.1. Kích thước vòng kháng khuẩn của 14 chủng vi khuẩn phân lập bằng các phương pháp khác nhau. 75
Bảng 4.7.2.1 Đường kính vòng kháng khuẩn sau khi ủ 24 và 48 giờ bằng phương pháp đục lỗ thạch. 77
Bảng 4.8.1. Đặc điểm hình thái của các chủng phân lập. 79


DANH SÁCH HÌNH
Hình 3.2.3.1 Cách đổ đĩa thạch. 40
Hình 3.2.3.2. Các cách ria cấy. 41
Hình 3.2.3.4. Các thao tác cấy truyền. 42
Hình 3.2.3.5. Dụng cụ chuẩn bị trước khi pha loãng và tráng đĩa được đặt trong tủ cấy vô trùng. 43
Hình 3.2.3.6. Cách pha loãng. 44
Hình 3.2.3.8. Đang đếm khuẩn lạc. 46
Hình 3.2.3.7. Các đĩa petri, máy đếm khuẩn lạc. 46
Hình 3.3.2.1. Sơ đồ sàng lọc nhóm vi khuẩn lactic acid trên môi trường MRS. 48
Hình 3.3.3.1.1. Các vòng tròn sắc tố violacein tiết ra bởi vi khuẩn CV026 khi có sự hiện diện của phân tử C6-HHL. 50
Hình 3.3.3.2.1 Khảo sát khả năng phân hủy C6-HHL của các chủng vi khuẩn phân lập và từ ngân hàng. 51
Hình 3.3.4.2.1 Phương pháp đục lỗ thạch. 53
Hình 3.3.4.3.1. Phương pháp giếng khuếch tán (well diffusion method) 55
Hình 3.3.4.4.1 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (disc-paper diffusion method) 56
Hình 4.3.1. Đường cong tăng trưởng của E. ictaluri khi nuôi trên môi trường BHI. 60
Hình 4.4.1 Đường chuẩn tương quan giữa nồng độ phân tử HHL và đường kính vòng tròn sắc tố violacein. 61
Hình 4.7.1.1.2. Khuẩn lạc DC 70
Hình 4.7.1.1.1. Khuẩn lạc G.VL1.2. 70
Hình 4.7.1.2.2. Khuẩn lạc DC 71
Hình 4.7.1.2.1. Khuẩn lạc G.VL1.2. 71
Hình 4.7.1.3.2. Khuẩn lạc T.TG1.4. 73
Hình 4.7.1.3.1. Khuẩn lạc G.VL1.2. 73
Hình 4.8.2. Mẫu 13. 80
Hình 4.8.1. Mẫu 1.1. 80
Hình 4.8.5. Mẫu 24.1. 80
Hình 4.8.4. Mẫu 20. 80
Hình 4.8.3. Mẫu 17. 80
Hình 4.8.6. Mẫu 35.1. 80
Hình 4.8.8. Mẫu 44. 81
Hình 4.8.7. Mẫu 38. 81
Hình 4.8.10. Mẫu 50.1.2. 81
Hình 4.8.9. Mẫu 50.1.1. 81
Hình 4.8.11. Mẫu Edwardsiella ictaluri 81
Hình 4.8.11. Mẫu 50.3. 81