Luận Văn Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng

Đồ án tốt nghiệp năm 2011
Đề tài: Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. . 3
TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHIM VÂY VÀNG . 3
1.2. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTICS 4
CHƯƠNG II . 10
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 10
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU . 10
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 12
2.2.1. Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu . 12
2.2.2. Phương pháp phân lập vi sinh vật 13
2.2.3. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh protease mạnh nhất: được đánh giá
qua hoạt tính sinh protease . 15
2.2.4. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng . 16
2.2.5. Phương pháp định danh chủng vi khuẩn (theo phương pháp truyền thống) 17
2.2.6. Phương pháp xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp . 19
2.2.7. Phương pháp nuôi cấy và thu canh trường chứa enzyme của chủng đã phân lập
trên môi trường nhân giống cấp 2 22
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 25
CHƯƠNG III . 26
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 26
3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG SINH PROTEASE CAO SỐNG
BÁM TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG . 26
3.2. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP . 28
3.3. ĐẶC ĐIỀM SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP . 29
3.3.1. Khả năng lên men các loại đường 29
3.3.2. Khả năng sinh hơi 31
3.3.3. Khả năng chịu muối . 32
3.3.4. Khả năng di động . 32
3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA
CHỦNG R2.1.5 PHÂN LẬP ĐƯỢC 33
3.4.1. Thời gian nuôi cấy thích hợp 33
3.4.2. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp . 35
3.4.3. pH thích hợp . 36
3.5. THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY CHỦNG R2.1.5 TRÊN MÔI TRƯỜNG NHÂN
GIỐNG CẤP 2 . 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO 41


MỞ ĐẦU
Việt Nam có bờ biển dài trên 3000km và vùng thềm lục địa hàng triệu km
2
là
điều kiện thuận lới để phát triển ngành thủy sản. Với truyền thống lao động cần cù sáng
tạo của con người Việt Nam đồng thời với sự định hướng đúng đắn của Đảng và Nhà
nước, ngành Thủy sản đã phá triển mạnh mẽ vươn lên trở thành ngành có kim ngạch
xuất khẩu đứng hàng thứ 3 chỉ sau dệt may và dầu khí. Năm 2010, sản lượng khai thác
thủy sản là 2.450,8 ngàn tấn, kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 4,94 tỷ USD; sản lượng
nuôi trồng thủy sản năm 2010 lên 2.706,8 ngàn tấn đã đưa Việt Nam đứng thứ 6 trong
số 10 nhà xuất khẩu thủy sản hàng đầu của thế giới và đứng thứ 5 trong khu vực châu
Á sau Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia và Philippines.
Để đẩy mạnh phát triển ngành thủy sản và khẳng định chủ quyền biển đảo, Chính
phủ đã định hướng phải tăng cường khai thác đánh bắt xa bờ và đẩy mạnh phát triển
nuôi các loài cá biển có giá trị kinh tế, trong đó có cá chim vây vàng - đối tượng nuôi
mới, có giá trị kinh tế cao. Tuy vậy muốn phát triển nuôi bền vững các đối tượng này
cần phải sản xuất thức ăn có chứa các chế phẩm vi sinh vật hữu ích (probiotics) giúp
tăng sức đề kháng, tăng khả năng tiêu hóa của cá trong điều kiện nuôi công nghiệp và
hạn chế ô nhiễm môi trường. Song hiện tại Việt Nam việc nghiên cứu chưa nghiên cứu
về chế phẩm probiotics dùng cho nuôi thủy sản còn rất hạn chế. Đặc biệt đối với cá
chim vây vàng, hiện chưa có chế phẩm dạng này. Xuất phát từ thực tế trên, em được
Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học giao thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập một
số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng”, với mục
đích phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme protease ứng
dụng trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotics dùng trong sản xuất thức ăn cho
cá chim vây vàng.
Nội dung của đề tài:
1) Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn sinh protease cao sống bám
trên cá chim vây vàng,
2) Xác định một số đặc tính của chủng có hoạt tính sinh protease cao,
3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng phân
lập được
Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn có các hạn
chế, em kính mong nhận được các ý kiến góp ý của quý thầy cô và bạn bè đồng nghiệp
để cho các nghiên cứu thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn!


CHƯƠNG I.
TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHIM VÂY VÀNG
Cá chim trắng vây vàng là loài cá biển có giá trị kinh tế cao, được nuôi nhiều ở
Đài Loan, Trung Quốc, Singapore . và tiêu thụ mạnh trên thị trường thế giới. Tuy
nhiên ở nước ta, cá chim trắng vây vàng là đối tượng khá mới mẻ. Với đường bờ biển
dài, diện tích mặt nước biển lớn, ngành nuôi cá biển đang trên đà phát triển mạnh. Đặc
biệt, điều kiện biển tự nhiên ở nước ta rất thích hợp với loài cá chim trắng vây vàng. Vì
môi trường sống của loại cá này là vùng biển ấm, vị trí rất thích hợp, những vùng vịnh,
đầm phá, eo biển, biển nội địa ít sóng gió. Bên cạnh đó, là chất lượng nước tốt, độ mặn
nước biển tương đối ổn định. Nguồn thức ăn cho cá có tự nhiên, thức ăn tổng hợp đơn
giản và giá thành không quá đắt.
Cá chim vây vàng còn có một tên gọi khác là cá sòng mũi hếch hay cá chim
trứng. Là loài cá ăn tạp, thiên về động vật, cá có thể kiếm thức ăn ở trong cát, cá trưởng
thành có thể bắt những động vật vỏ cứng như: ngao, cua, ốc. Giai đoạn cá giống thức
ăn là động vật phù du và động vật đáy, chủ yếu là luân trùng, nauplius của Artemia. Cá
con ăn tôm cá nhỏ, hai mảnh vỏ nhỏ. Thức ăn chính của cá trưởng thành là các loại tôm
cá nhỏ.Trong điều kiện ương nuôi cá dài 2 cm thức ăn là cá tạp xay nhỏ, tôm tép băm
nhỏ, thức ăn tổng hợp. Cá trưởng thành ăn tôm nhỏ và thức ăn công nghiệp hoặc hoàn
toàn thức ăn công nghiệp trong nuôi thương phẩm. Sau đây là hệ thống phân loại của
cá chim vây vàng:
Nghành: Vertebrata
Lớp: Osteichthyes
Bộ: Perciformes
Họ: Carangidae
Giống: Trachinotus
Loài: Trachinotus blochii Lacepede, 1801
Theo Borut Forlan (2004) cá chim vây vàng sống ở vùng biển hở và được tìm
thấy ở Thái Bình Dương, Đại Tây Dương, Ấn Độ Dương. Ở châu Á, cá chim vây vàng
phân bố ở miền Nam Nhật Bản, Indonesia, Trung Quốc (Hoàng Hải, Đông Hải, Quảng
Đông, Phúc Kiến, Hải Nam), Đài Loan. Ở Việt Nam, cá chim vây vàng được tìm thấy
trên vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam Bộ.
Hình 1.1 Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii)
1.2. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTICS
Thuật ngữ “probiotic” được Lilly và Stiwell đề xuất năm 1965 để mô tả những
chất sản sinh bởi vi sinh vật làm tăng trưởng một vi sinh vật (hoặc sinh vật) khác. Năm
1989, Parker lại định nghĩa thêm cho rõ:”Probiotic là những vi sinh vật (chủ yếu là vi
khuẩn) có khả năng cộng sinh (hoặc hợp sinh) trong đường ruột có tác dụng cân bằng
hệ vi sinh vật trong đó có một số tác dụng hữu ích cho vật chủ” (Parker, 1989). Nghiên
cứu ứng dụng probiotic mới được chú ý trong 20 năm trở lại đây, nhưng tác dụng của
nó đã được nhận thấy từ lâu. Elie Metnhicoff là người đầu tiên đặt nền móng cho việc
sử dụng probiotic (Metnhicoff, 1908). Năm 1908, ông đề nghị sử dụng vi khuẩn lactic
(Lactobacterium delbruekii spp bulgaricus) để kéo dài tuổi thọ con người. Ngày nay
chế phẩm probiotic được sử dụng khá hiệu quả trong chăn nuôi đặc biệt là trong nuôi
tôm, trồng trọt, trong bảo vệ sức khỏe con người và bảo vệ môi trường. Tuy nhiên việc
dùng chế phẩm này vào nuôi trồng thủy sản (tôm, cua, cá, nhuyễn thể ) mới bắt đầu
trong hơn thập kỷ gần đây.
Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản giúp phân hủy các chất hữu cơ trong
nước (chất hữu cơ là một trong nhiều nguyên nhân làm môi trường nước bị ô nhiễm),
hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy, giảm các độc tố trong
môi trường nước (do các chất khí: NH
3, H
2
S phát sinh), do đó sẽ làm giảm mùi hôi
trong nước, giúp tôm cá phát triển tốt, nâng cao khả năng miễn dịch của tôm cá (do
kích thích tôm, cá sản sinh ra kháng thể). Hơn nữa chế phẩm probiotic sẽ ức chế sự
hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do các loài vi sinh vật có lợi sẽ cạnh
tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật có hại). Trong môi trường nước,
nếu vi sinh vật có lợi phát triển nhiều sẽ kìm hãm, ức chế, lấn át sự phát triển của vi
sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế được mầm bệnh phát triển để gây bệnh cho tôm cá.
Đồng thời chế phẩm probiotic giúp ổn định độ pH của nước, ổn định màu nước do
probiotic hấp thu chất dinh dưỡng hòa tan trong nước nên hạn chế tảo phát triển nhiều.
Thành phần chế phẩm probiotic thường có những nhóm vi sinh vật sau:
- Các nhóm vi sinh vật cơ bản: Vi khuẩn lactic, Vi khuẩn Bacillus, Vi khuẩn
quang dưỡng khử H2
S – vi khuẩn tía lưu huỳnh, Nấm men (men rượu Saccharomyses).
- Các nhóm vi sinh vật phụ: Nhóm vi khuẩn nitrat (Nitrosomonas và
Nitrobacter), Nhóm xạ khuẩn, Nhóm nấm mốc.
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Tại Nhật Bản, chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M (các vi sinh vật hữu hiệu) do
giáo sư, tiến sỹ Teruo Higa, Trường đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản đề xuất năm
1980 đã được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng như bảo vệ môi trường
đều cho kết quả khả quan (Higa, 1980). Đến nay chế phẩm này được hơn 80 nước và
vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á và Thái Bình Dương trong đó có
Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam.
Griffith (1995) thông báo nhờ việc đưa probiotic vào nuôi tôm giống ở Ecuador
trong năm 1992, mà các trại nuôi tôm giống giảm thời gian nghỉ để làm vệ sinh ở các
bể nuôi từ 7 ngày trong một tháng đến 21 ngày trong một năm, sản lượng tôm giống
tăng 35%, và giảm sử dụng các chất diệt khuẩn đến 94% .
Ở Châu Á đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi tôm,
đặc biệt ở Thái Lan. Jiravanichpaisal & cộng sự (1997) đã sử dụng Lactobacillus sp.
trong nuôi tôm sú (P. monodon Fabrius) . Ở Trung Quốc, nghiên cứu probiotic trong
nuôi thủy sản được tập trung vào vi khuẩn quang hợp. Qiao Zhenguo & cộng sự (1992)
nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp sử dụng cho tôm (P. chinensis) bằng cách cho
vào thức ăn hoặc cho và nước nuôi tôm cho thấy có sự gia tăng khả năng phát triển của
tôm, loại trừ nhanh chóng NH
3
-N, H2
S, acid hữu cơ và những chất có hại, cải thiện
chất lượng nước, cân bằng độ pH.
Ngày nay probiotics được sử dụng rộng rãi và rất hiệu quả trong việc phòng bệnh
cho động vật thủy sản và con người. Hiện có khoảng 500 loại chế phẩm sinh học đang
lưu thông trên thị trường, trong đó có khoảng 430 loại dùng để xử lý môi trường và
trên 60 loại dùng để trộn vào thức ăn nhằm mục đích kích thích tăng trưởng, tăng sức
đề kháng nhưng chủ yếu vẫn tập trung vào xử lý môi trường. Các loại chế phẩm này
có nguồn gốc từ nhiều nước: Trung Quốc, Indonesia, Đài Loan, Anh, Mỹ, Ấn Độ, Hàn
Quốc, Úc, Đức, và Thái Lan (Aditya et al., 2008; Wang et al., 2008).
Để tạo thành các chế phẩm hoàn chỉnh, các probiotics có thể được sử dụng kết
hợp với các chất có hoạt tính sinh học khác. Chẳng hạn, chế phẩm De-Odorase của
hãng Bayer sử dụng hoạt chất chính được chiết xuất từ thực vật (từ cây Yucca) kết hợp
với nấm men và vi khuẩn. Chế phẩm này giúp loại bỏ các khí độc trong ao ương nuôi
tôm cá như khí: NH
3, H
2S, NO
2
do đó giảm ô nhiễm môi trường nuôi. Tuy nhiên,
chế phẩm này có nhược điểm là không khống chế được vi khuẩn, nấm, nguyên sinh
động vật trong ao. Chế phẩm BZT (BZT Aquaculture và BZT Waster digester) là sự
kết hợp giữa các vi khuẩn và enzyme, giúp xử lý lớp bùn đáy ao ô nhiễm và làm sạch
môi trường. Các vi khuẩn có lợi trong chế phẩm này bao gồm Lactobaccilus spp.,
Nitromonas spp., Nitrobacter spp., Bacillus spp., và Clostridium spp.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Hoàng Thị Huệ An và Nguyễn Đại Hùng (2004), Bài giảng Hóa phân tích,
Đại học Nha Trang.
2. Khuất Hữu Thanh (2008), “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học hoàn
thiện chế phẩm Bio-TS3 có khả năng tăng sức đề kháng của tôm trong nuôi tôm sú
thâm canh”, Hội thảo đánh giá kết quả thực hiện đề tài dự án CNSH Nông nghiệp,
Thủy sản giai đoạn 2007-2008.
3. Lương Đức Phẩm (2007), Các chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi và
nuôi trồng thủy sản, Nhà xuất bản nông nghiệp, trang 112-156
4. Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản nông nghiệp,
Hà Nội.
5. Nguyễn Đức Hùng, Lê Đình Hùng và Huỳnh Lê Tâm (2004), Sổ tay kiểm
nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.
6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Tỵ (2005), Vi sinh vật
học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
7. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Phạm Thị Trân Châu (1978),
Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
8. Nguyễn Trọng Nho, Tạ Khắc Thường, Lục Minh Diệp (2006), Kỹ thuật nuôi
giáp xác, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
9. Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mỹ phẩm, Nhà xuất bản giáo dục.
10. Vũ Ngọc Bội (2003), “Nghiên cứu sản xuất protease từ Bacillus subtilis và sử
dụng để thủy phân bột đạm từ cá tạp”, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ, mã
số B2000-33-33, Trường Đại học Thủy sản Nha Trang.
11. Vũ Ngọc Bội (2004), “Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng
enzyme protease từ B.subtilis S5”, Luận án tiến sỹ sinh học, mã số 1.05.10, Trường Đại
học Khoa học tự nhiên- Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
12. Breed. Robert s, 1948. Bergey’s manual of determin ative bacteriology
13. Gitishree Das1 and M.P. Prasad, Isolation, purification & mass production of
protease enzyme from bacillus subtilis
14. . Sirirat Rengpipat, Sombat Rukpratanporn, Somkiat Piyatirativivorakul,
Piamsak Menasveta, 1998. Probiotics in aquaculture: A case study of probiotics for
Larvae of the Black Tiger Shrimp (penaeus monodon)
15. Susmita Roy, Kaushal Mishra, Sanhita Chowdhury, Ashoke R Thakur and
Shaon Raychaudhuri Department of Biotechnology, West Bengal University of
Technology, BF-142, Sector 1, Salt Lake,Calcutta-700064, India West Bengal State
University, Barasat North 24 Parganas, Barasat Government College Annexe Building,
10KNC Road, Kolkata-00124, India, Isolation and Characterization of Novel Metal
Accumulating Extracellular Protease Secreting Bacteria from Marine Coastal Region
of Digha in West Bengal, India
16. Victoria E. B. Lee and Deokjin Jahng, Isolation of Protease Producing
Aerobic Thermophilic Bacteria for Digestion of Excess Sludge