Thạc Sĩ Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn Bacillus spp từ đầm nuôi tôm tại Hải Phòng làm nguồn nguyê

Luận văn thạc sĩ năm 2011
Đề tài: Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn Bacillus spp từ đầm nuôi tôm tại Hải Phòng làm nguồn nguyên liệu sản xuất probiotic trong nước

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình NTTS trên thế giới .3
1.1.1. Sản lượng NTTS .3
1.1.2. Diện tích NTTS .5
1.2. Tình hình NTTS tại Việt Nam 6
1.2.1. Sản lượng NTTS .6
1.2.2 Diện tích NTTS 7
1.3. Tình trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh trong NTTS .9
1.3.1. Tình trạng ô nhiễm môi trường trong NTTS 9
1.3.2. Tình trạng dịch bệnh trong NTTS 10
1.4. Các bệnh thường gặp trong nuôi trồng thủy sản .11
1.4.1. Các nhóm tác nhân gây bệnh thường gặp trong nuôi trồng thủy sản .11
1.4.2. Bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio spp. (Vibriosis) .12
1.4.2.1. Một số đặc điểm phân loại Vibrio .12
1.4.2.2. Vibriosis trên đối tượng thủy sản 13
1.4.2.3. Các biện pháp phòng trị bệnh Vibriosis trên đối tượng NTTS .14
1.5. Probiotic và các vi sinh vật được sử dụng làmchế phẩm probiotic 15
1.5.1. Khái niệm về probiotic .16
1.5.2. Cơ chế hoạt động của các nhóm vi sinh vật probitic .16
1.5.3. Một số nhóm vi sinh vật probiotic 18
1.5.4. Một số đặc điểm sinh học của chi Bacillus ứng dụng làm chế phẩm
probiotic .19
1.5.3.1. Đặc điểm sinh học tế bào 19
1.5.3.2. Đặc tính probiotic của chi Bacillus .20
1.6. Ứng dụng của probiotic trong NTTS 20
1.6.1. Ứng dụng probiotic trong NTTS trên thế giới 20
1.6.2. Ứng dụng probiotic trong NTTS ở Việt Nam .22
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26
2.2. Vật liệu nghiên cứu .26
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu: .26
2.2.2. Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn .26
2.2.3. Một số thuốc thử và hóa chất dùng trong phảnứng sinh hóa, sinh lý .26
2.3. Phương pháp nghiên cứu 26
2.3.1. Phương pháp thu mẫu 26
iv
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu .27
2.3.3. Phương pháp phân lập, chọn lọc, tinh sạch vàgiữ giống vi khuẩn Bacillus
spp 27
2.4. Xác định khả năng ức chế Vibriospp gây bệnh 27
2.4.1. Cô lập chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus. 28
2.4.2. Ức chế vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus 28
2.4.3. Đồng nuôi cấy trong nước biển .28
2.5. Nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi
khuẩn phân lập từ vùng nuôi tôm có khả năng ức chế Vibrio gây bệnh .29
2.6. Phân loại và định danh vi khuẩn .29
2.7. Phương pháp xử lý, phân tích số liệu .31
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .33
3.1. Phân lập và lựa chọn một số chủng vi khuẩn Bacillusspp ruột tôm sú và bùn
đáy đầm nuôi tôm sú tại Hải Phòng. 33
3.2. Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn phânlập với vi khuẩn gây bệnh
tôm sú Vibriospp .34
3.2.1. Cô lập vi khuẩn V. alginolyticus và V. parahaemolyticus 34
3.2.2. Ức chế vi khuẩn V. alginolyticus và V. parahaemolyticusthể hiện bằng
vòng tròn kháng khuẩn .37
3.2.3. Ức chế sự phát triển của vi khuẩn V. alginolyticus và V. parahaemolyticus
trong môi trường lỏng 39
3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng củachủng vi khuẩn phân lập 41
3.4. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình tháivi khuẩn phân lập .44
3.5. Phân tích trình tự gen 16S rDNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại của
chủng vi khuẩn phân lập 46
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53
4. 1. Kết luận 53
4.2. Kiến nghị .54
TÀI LIỆU THAM KHẢO .55
PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU
Nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam đang là một trong những nghề phát triển nhanh
và mạnh nhất. Tuy nhiên, do thiếu quy hoạch đồng bộvà phát triển quá nhanh trong 5
- 6 năm gần đây, dịch bệnh đã xảy ra ở một số khu vực nuôi thủy sản tập trung hoặc
nuôi công nghiệp với tần suất khá thường xuyên.
Nhiều loài vi khuẩn thuộc các chi Vibrio, Pseudomonas,nấm và một số vi sinh
vật khác là tác nhân gây bệnh trên cá, giáp xác, nhuyễn thể. Khi động vật thủy sản bị
nhiễm bệnh thường phải dùng một số loại kháng sinh như tetracycline, streptomycin,
rifampicin, oxytetraxycline . để điều trị. Những loại kháng sinh này nếu sử dụng trong
giai đoạn sản xuất giống thường làm cho ấu trùng chậm lớn, còi cọc, các giai đoạn
biến thái xảy ra không đều, dẫn đến tỷ lệ sống của ấu trùng thấp. Nếu sử dụng kháng
sinh trong quá trình nuôi thương phẩm dẫn đến hiện tượng tích lũy kháng sinh trong
sản phẩm sau thu hoạch làm giảm chất lượng, chi phísản xuất tăng trong khi giá trị
sản phẩm giảm. Việc lạm dụng kháng sinh trong nghề nuôi hiện nay khá phổ biến nên
hiện tượng kháng kháng sinh của nhiều chủng vi khuẩn đang là vấn đề hết sức nan
giải. Liệu pháp vắc-xin còn mới mẻ ở Việt Nam và cũng không có đủ loại vắc-xin để
phòng chống các bệnh phổ biến trên đối tượng nuôi. Vì vậy, việc sản xuất giống cũng
như nuôi thương phẩm gặp nhiều khó khăn trong việc nâng cao sức đề kháng cho vật
nuôi.
Một xu hướng mới hiện nay được áp dụng nhằm ngăn ngừa dịch bệnh với nhiều
đối tượng nuôi là việc sử dụng chế phẩm men vi sinhsống (probiotics) nhằm giúp
động vật thủy sản có khả năng hấp thu dinh dưỡng tốt hơn đồng thời cải tạo được môi
trường nuôi, từ đó động vật thủy sản sẽ có khả năngchống chịu bệnh tật và áp lực môi
trường tốt hơn.
Xu hướng nghiên cứu phân lập một số vi khuẩn có tiềm năng sử dụng là
probiotic trong NTTS đang là một hướng nghiên cứu mới, được phát triển ở thế giới từ
những năm 1990. Ở Việt Nam, mặc dù nghề NTTS đã phát triển từ khá lâu nhưng
hướng nghiên cứu này còn rất mới mẻ, chưa có nhiều nghiên cứu lựa chọn các chủng
vi khuẩn từ vùng nuôi để dùng làm chế phẩm probiotic phù hợp với điều kiện thực tiễn
NTTS Việt Nam. Do đó, để có cơ sở phát triển các chế phẩm probiotic trong nước có
giá thành hạ, phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu Việt Nam, chúng tôi lựa
chọn đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn Bacillusspp từ
2
đầm nuôi tôm tại Hải Phòng làm nguồn nguyên liệu sản xuất probiotic trong
nước”.
Mục tiêucủa đề tài là phân lập được một số chủng vi khuẩn Bacillusspp có tiềm
năng sử dụng như là vi khuẩn probiotic với mục đíchlà cơ sở tạo nguồn vi khuẩn để
sản xuất chế phẩm probiotic trong nước.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Phân lập một số chủng vi khuẩn Bacillusvà lựa chọn ngẫu nhiên một số
chủng phân lập được;
- Đánh giá khả năng đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh thường gặp
trên tôm là Vibrio algilyticusvà V. parahaemolyticustheo 3 cách: cấy
vuông góc, đĩa giấy và đồng nuôi cấy;
- Đặc điểm sinh thái của chủng vi khuẩn lựa chọn (t
0
C, pH và % NaCl)
- Định danh vi khuẩn lựa chọn dựa trên đặc điểm sinh hóa, sinh lý và so
sánh trình tự gen 16S rDNA.
3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình NTTS trên thế giới
1.1.1. Sản lượng NTTS
Tổng sản lượng khai thác và NTTS trên toàn thế giớiđạt khoảng 142 triệu tấn
vào năm 2008 trong đó sản lượng từ NTTS (bao gồm cảnước ngọt và nước mặn) vào
khoảng 52 triệu tấn, chiếm 46% tổng sản lượng. Bảng1 cho thấy sản lượng từ NTTS
liên tục tăng từ năm 2004 đến 2009 [47].
Bảng 1: Sản lượng NTTS thế giới trong các năm 2004 - 2009 (triệu tấn)

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tham khảo tiếng Việt
1. Bộ Thủy Sản (1994 a), “Chương trình phát triển nghề cá từ năm 1994 - 1995 đến
2000”, Báo cáo tổng kết hoạt động 5 năm nghề cá (1993-1998), tr 32- 45, NXB Nông
nghiệp, Hà Nội.
2. Bộ Thủy sản (2002), Quyết định của bộ trưởng bộ thuỷ sản V/v ban hành Quy chế
khảo nghiệm giống thuỷ sản, thức ăn, thuốc, hoá chất và chế phẩm sinh học dùng
trong nuôi trồng thủy sản, QĐ -BTS 18/2002.
3. Bộ Thủy Sản (2006), Báo cáo đánh giá kết quả thực hiện chương trình phát triển nuôi
trồng thủy sản giai đoạn 2000-2005 và biện pháp thực hiện đến năm 2010, tr 68-100.
4. Nguyễn Lân Dũng, (1983), Thực tập vi sinh vật học,NXB Đại học và Trung học
chuyên nghiệp Hà Nội.
5. Võ Thị Hạnh , Lê Thị Bích Phượng, Trương Hồng Vân, Lê Tấn Hưng, Trần Thạnh
Phong, (2004), “Kết quả khảo nghiệm chế phẩm VEM vàBIOII trên ao nuôi tôm sú”,
tr 257-266, Tuyển tập Hội thảo Toàn Quốc về nghiên cứu và ứng dụng Khoa học Công
nghệ trong nuôi trồng thuỷ sảntại Vũng Tàu 22-24/12/2004.
6. Võ Thị Hạnh , Lê Thị Bích Phượng, Trương Hồng Vân, Lê Tấn Hưng, Trần Thạnh
Phong (2004), “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm VEM dùng trong nuôi trồng thuỷ sản”,
tr 911-918, Tuyển tập Hội thảo Toàn Quốc về nghiên cứu và ứng dụng Khoa học Công
nghệ trong nuôi trồng thuỷ sảntại Vũng Tàu 22-24/12/2004.
7. Võ Thị Hạnh, Lê Bích Phượng, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Trần Thạnh
Phong, Võ Minh Sơn, Lê Thị Nga, (2005), “Kết quả khảo nghiệm chế phẩm VEM và
BioII trên ao nuôi tôm sú”, tr. 257-265, Tuyển tập hội thảo toàn quốc về NC&UD
KHKT trong nuôi trồng thủy sản, Nhà xuất bản nông nghiệp TP HCM-2005.
8. Đỗ Thị Hòa (1994), “Nghiên cứu một số bệnh chủ yếu trên tôm sú Penaeus
monodon ở khu vực biển miền Trung Việt Nam và đề ra biện pháp phòng trị thích
hợp”, Khoa học công nghệ Thủy sản, tập 3, Trường Đại học Thủy sản - Nha Trang.
9. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang tề, Nguyễn Hữu Dũng, Đỗ Thị Muội, (2004), Bệnh học
thủy sản, NXB Nông Nghiệp, tr 224- 231.
10. Trần Thị Cẩm Hồng, (2008), Khảo sát hiệu quả của sử dụng men vi sinh trong thực
tế sản xuất giống tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii), Luận văn tốt nghiệp
cao học, Khoa Thủy sản - Đại học Cần Thơ.
11. Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trương Thị Hồng Vân (2003),
“Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Probiotic BIO II và kết quả thử nghiệm trên ao nuôi
tôm”, tr. 75-79, Tuyển tập báo cáo khoa học tại Hội nghị công nghệ sinh học toàn
Quốc 2003, Hà Nội, 16-17/12/2003, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
56
12. Trần Lưu Khanh, (2008), Báo cáo một số kết quả quan trắc, cảnh báo môi trường
tại một số vùng nuôi hải sản, cảng cá, bến cá tập trung, Viện Nghiên cứu Hải sản.
13. Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa, Nguyễn Thanh Phương, (2000),
“Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh (probiotics) lên điều kiện ương nuôi ấu trùng tôm
càng xanh (Macrobrachium rosenbergii)”, Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ.
14. Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trương Thị Hồng Vân, Lê Tấn Hưng (2003),
“Khảo sát khả năng cạnh tranh và đối kháng của các vi sinh vật có trong chế phẩm
BioII với vi khuẩn gây bệnh cho tôm”, Tuyển tập báo cáo khoa học tại Hội nghị công
nghệ sinh học toàn Quốc 2003, Hà Nội, 16-17/12/2003, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ
thuật, tr. 253-256.
15. Nguyễn Thanh Phương, (2007), Nghiên cứu nâng cao năng suất ương ấu trùng
tôm càng xanh áp dụng mô hình nước xanh cải tiến, 70 trang,,Báo cáo khoa học, Sở
Khoa học công nghệ Cần Thơ
16. Thông tin KHCN, (1999), “Vi khuẩn - một nguồn thứcăn bổ sung trong NTTS”,
số 12, tr. 12-13.
17. Võ Thị Thứ, Trương Ba Hùng, (2005), “Len men chế phẩm sinh học BIOF và ứng
dụng trong nuôi thủy sản”, tr. 857-865, Tuyển tập nghiên cứu hội thảo toàn quốc về
NC&UD KHKT trong nuôi trồng thủy sản,Nhà xuất bản nông nghiệp TP HCM-2005.
18. Võ Thị Thứ, Trương Ba Hùng, Nguyễn Minh Dương, La Thị Nga, Lê Thu Hiền,
Phạm Minh Hà, Lê Doanh Toại, Nguyễn Trường Sơn và Đào Thị Thanh Xuân, (2005),
tr. 815-832, “Nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis, Bacilus megaterium, Bacillus
licheniformis và Lactobacilusđể sản xuất chế phẩm sinh học BIOCHIE xử lý nước
nuôi thủy sản”, Tuyển tập hội thảo toàn quốc về NC&UD KHKT trong nuôi trồng
thủy sản, Nhà xuất bản nông nghiệp TP HCM-2005.
19. Nguyễn Đình Trung (2004), Bài giảng quản lý chất lượng nước trong nuôi trồng
thủy sản, NXB Nông Nghiệp.
20. Trung Tâm Tin học và Thống kê , (2008), Báo cáo thực hiện kế hoạch năm. Bộ
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.
21. Vũ Ngọc Út,(1999), “Ứng dụng chế phẩm sinh học (probiotics) trong nuôi trồng
thủy sản” - Khoa Thủy sản - Đại học Cần Thơ.
Tài liệu tham khảo tiếng Anh
22. Al-Harbi, A.H., (2003). “Faecal coliforms in pond water, sediments and hybrid
tilapia Oreochromis niloticusx Oreochromis aureusin Saudi Arabia”, Aquac. Res,
34 (7), pp. 517-518.
23. Atlas, R.M., (1997), “Handbook of Microbiological Media - 2nd edn”, Boca Raton,
FL: CRC press, pp. 1026 – 1027; 744.
57
24. Austin, B., & Austin, D.A., (1987), “Bacterial fishpathogens, disease in farmed
and wild fish”, Ellis Horwood Limited Publishers, Chichester.
25. Balca´zar, J.L., de Blas, I., Ruiz-Zarzuela, I., Cunningham, D., Vendrell,D.,
Muzquiz, J.L.,(2006), “Review the role of probiotics in aquaculture”. Veterinary
Microbiology114, pp. 173-186.
26. Balcázar, J.L., Rojas-Luna, T., (2007),“Inhibitory activity of probiotic Bacillus
subtilisUTM 126 against vibrio species confers protection against vibriosis in
juvenile shrimp (Litopenaeus vannamei)”. Curr. Microbiol, 55(5)p. 409-12.
27. Barbosa D.C., Bae, J.W., Von Der Weid, I., Vaisman,N., Nam, Y.D,. Chang,
H.W., Park, Y.H., Seldin, L., (2006), “Halobacillus blutaparonensissp. nov., a
moderately halophilic bacterium isolated from Blutaparon portulacoidesRoots in
Brazil”, Journal of Microbiology and Biotechnology,Vol 16 (12), pp. 1862-1867.
28. Bassler, B.L., and Losick, R., (2006), “Bacteriallyspeaking”. Cell,125, pp.237–246
29. Be, D.T., Diep, C.N., Phu, T.Q., (2008), “Nitrogen Removal in wastewater of
catfish fish-ponds by Pseudomonas stutzeriand Rhodopseudomonas sp.”, The
international symposium on catfish aquaculture in Asia at Can Tho University -
Vietnam
30. Blancheton, J.P., Calvas, J., Michel, A.H., Vonau,V., (1987), “Intensive shrimp
breeding process”, US Patent, 119/205.
31. Bogatyrenko, E.A., Buzoleva, L.S., Chi. Z., (2010)“Potential probiotics of the
Far Eastern trepang Apostychopus japonicusproducing digestive enzymes”,
Mikrobiologiya, 2010, Vol. 79 (2), pp. 193–198.
32. Bonde, G.J., (1981), “Bacillusfrom marine habitats: Allocation to phena
established by numerical techniques”, In R.C. W. Berkerley and M. Goodfelow
(eds.). The Aerobic Endospore Forming Bacteria: Classification and Identification,
Academic Press, London.
33. Boyd, C.E., (1996). Effect of Treatment with a Commercial Bacterial Suspension
on Water Quality in Catfish Ponds, Dept. of Fisheries and Allied Aquacultures
Alabama Agricultural Experiment Station, Auburn University, Alabama.
34. Bruno, M.E.C and Montville,T.J., (1993), “Common mechanistic action of
bacteriocins from lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol, 59, pp. 3003-3010.
35. Caton, T.M., Witte, L.R., Nguyen, H.D., Buchheim, J.A., Buchheim, M.A.
and Schneegurt, M.A., (2004), “Halotolerant aerobic heterotrophic bacteria from
the Great Salt Plains of Oklahoma”, Microb. Ecol., 48, pp. 449–462