Thạc Sĩ Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoc

MỞ ĐẦU

Khi con người có cuộc sống định cư, khoảng 8000 năm trước Công nguyên, ở khu vực Tiểu Á và lưu vực sông Nin người ta đã bắt đầu việc trồng trọt truyền thống với mục đích duy trì và cải thiện chất lượng giống cây trồng nhằm thỏa mãn yêu cầu của con người ngày một tốt hơn. Con người đã biết tạo ra giống cây trồng mang các đặc tính mong muốn bằng phương pháp lai tạo giống (lai hữu tính giữa hai dòng cây trồng). Phương pháp này cần nhiều thời gian, công sức và trong nhiều trường hợp cây lai thu được kèm theo cả tính trạng không mong muốn.
Ngày nay, công nghệ gen sử dụng các phương pháp hiện đại đã khắc phục được các hạn chế đó. Công nghệ gen cho phép các nhà di truyền và chọn giống thực vật xác định và thiết kế các gen đặc hiệu cho các mục tiêu mong muốn (kể cả các gen có nguồn gốc từ các sinh vật khác loài) rồi chuyển các gen này vào các giống đang sử dụng, tạo ra những giống cây trồng biến đổi gen mang những đặc tính mới đáp ứng yêu cầu của con người và có thể đem lại lợi ích quan trọng như tăng tính chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng năng suất và chất lượng, cải thiện môi trường nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu hoá học cần sử dụng. Công nghệ gen thực vật còn mở ra một khả năng mới là sử dụng thực vật như một nhà máy sản xuất các loại thuốc cần thiết cho con người như vitamin, enzyme, kháng thể, vacxin và các loại thuốc chữa bệnh khác [3].
Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, bên cạnh những gen có giá trị mã hoá cho các tính trạng mong muốn, các promoter cần thiết cho sự biểu hiện của các gen cũng nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu công nghệ gen thực vật. Promoter là thành phần quan trọng trong cấu trúc của tất cả các gen, khởi đầu cho sự phiên mã, đóng vai trò then chốt trong việc biểu hiện gen. Việc phân lập các promoter biểu hiện gen hữu hiệu trên cây trồng, đặc biệt là promoter đặc hiệu cho từng loại cây, biểu hiện trong các loại mô tế bào khác nhau ngày càng được quan tâm đến. Nhiều promoter từ các gen ở thực vật được phân lập trong số đó phải kể đến promoter ubiquitin gen ngô, promoter gen rbcS (ribulose – 1,5-bisphosphate carboxylase small subunit), promoter của gen mã hóa sucrose synthase .[4]. Ubiquitin - protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) với phân tử lượng nhỏ, có


mặt trong mọi tế bào ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng, protein này tham gia vào quá trình phân giải polypeptide trong tế bào chất, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào và chuyển hóa các chất trong tế bào. Promoter của Ubiquitin gen từ cây ngô được sử dụng rộng rãi trong công nghệ gen thực vật [22], [41], [53].
Bèo tấm là cây một lá mầm nhỏ nhất, có hàm lượng protein và polysaccharide cao. Với đặc thù cấu trúc và quá trình trao đổi chất, bèo tấm được sử dụng trong công nghệ gen thực vật như nhà máy sản xuất protein tái tổ hợp. Một số promoter bèo tấm đã được phân lập như promoter của các gen SSU5A, SSU5B, promoter của gen NPR1 (negatively phytochrome regulated1) . có phản ứng với điều kiện chiếu sáng hoặc cảm ứng ABA trong các nghiên cứu về quá trình quang hợp ở cây [18], [61]. Để tăng cường hiệu quả chuyển gen, ngoài sử dụng promoter truyền thống như promoter 35S CAMV, promoter Ubiquitin từ loài bèo tấm Lemna minor đã phân lập, nghiên cứu và hoàn thiện ở Mỹ, đã được đánh giá có hiệu quả cao hơn và đăng ký thành patent [24]. Ở Việt nam có 3 loài bèo tấm được phát hiện thấy là Lemna aequinoctialis, Spirodela polyrrhiza và Wolffia globosa ở nhiều vùng
khác nhau
Nhằm mục đích nghiên cứu phân lập promoter đặc hiệu từ các loài bèo tấm Việt Nam phục vụ cho việc thiết kế tiếp theo các vector mang những gen đem lại lợi ích cho con người để chuyển vào bèo tấm, chúng tôi xin đăng ký thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2” với các nội dung chính sau đây:

1. Hoàn thiện các phương pháp tách DNA tổng số từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2;
2. Nghiên cứu thiết kế các mồi đặc hiệu và nhân đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2 bằng PCR;
3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2.


MỤC LỤC

Trang


MƠ ĐÂU 1

Chương 1. TÔNG QUAN TAI LIÊU 3

1.1. Giới thiệu chung về cây bèo tấm 3

1.1.1. Phân bố của bèo tấm 3

1.1.2. Đặc điểm hình thái bèo tấm 3

1.1.3. Cây phân loại bèo tấm 5

1.1.4. Hình thức sinh sản của bèo tấm 5

1.1.5. Hệ gen của bèo tấm 7

1.1.6. Giá trị dinh dưỡng 8

1.1.7. Tiềm năng sử dụng bèo tấm trong công nghệ sinh học 9

1.2. Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật 10

1.2.1. Cấu trúc gen sinh vật 10

1.2.2. Cấu trúc promoter 11

1.2.3. Vai trò biểu hiện gen của promoter 13

1.2.4. Phân loại promoter 13

1.2.5. Ứng dụng promoter trong công nghệ gen thực vật 15

1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở bèo tấm 17

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 19

Chương 2. NGUYÊN LIÊU VA PHưƠNG PHAP NGHIÊN CưU 21

2.1. Nguyên liệu 21


2.1.1. Nguyên liệu thực vật 21

2.1.2. Hóa chất 21

2.1.3. Thiết bị 22

2.2. Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thực vật 22

2.2.2. Phương pháp điện di DNA trên gel Agarose 24

2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 24

2.2.4. Các phương pháp sử dụng để tách dòng gen 26

2.2.5. Xác định trình tự gen 30

2.2.6. Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng 30

Chương 3. KÊT QUA VA THAO LUÂN 31

3.1. Tách chiết DNA tổng số từ bèo tấm 31

3.2. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ở loài S. polyrhiza 33

3.2.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 33

3.2.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pJET1.2 33

3.2.3. Xác định đoạn điều khiển biểu hiện gen bằng RE 38

3.2.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter. 39

3.3. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ở loài L. aequinoctialis 43

3.3.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 43

3.3.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pCR1.2 44

3.3.3. Xác định đoạn điều khiển biểu hiện gen bằng RE 46

3.3.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter. 48

KÊT LUÂN VA ĐÊ NGHI 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54