Tiến Sĩ Nghiên cứu phân biệt loài phụ salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuậ

Mở đầu​

Salmonella là nhóm vi sinh vật gây bệnh đường ruột nguy hiểm, được quan
tâm bởi các nhà nghiên cứu bệnh học, dịch tễ học, vệ sinh môi trường và an toàn vệ
sinh thực phẩm. Về bệnh học, Salmonella được quan tâm nhiều đến đặc điểm, cách
thức, liều lượng gây bệnh, đặc điểm phân loại, kháng nguyên, biểu hiện lâm sàng,
phương pháp chẩn đoán và phương pháp điều trị Về khía cạnh dịch tễ học và vệ
sinh môi trường, Salmonella được quan tâm đến đặc điểm phân bố trong môi
trường, đặc điểm truyền bệnh và gây dịch Về an toàn vệ sinh thực phẩm,
Salmonella là chỉ tiêu được đặc biệt quan tâm vì khả năng gây bệnh rất nghiêm
trọng, gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm. Tất cả các qui định về an toàn vệ sinh thực
phẩm đều không cho phép sự hiện diện của vi khuẩn này trong 25g thực phẩm.
Giống Salmonella có hai loài chính là S. enterica và S. bongori được chia
thành 2339 kiểu huyết thanh. Trong số đó, loài S. enterica được chia thành 6 loài
phụ gồm 2321 kiểu huyết thanh được phân bố trong các loài phụ như sau: 1379 ở S.
enterica subsp. enterica (I), 466 ở S. enterica subsp. salamae (II), 93 ở S. enterica
subsp. arizonae (IIIa), 309 ở S. enterica subsp. diarizonae (IIIb), 64 ở S. enterica
subsp. houtenae (IV), 10 ở S. enterica subsp. indica (VI). Loài S. bongori (được coi
là loài phụ V) có 18 kiểu huyết thanh. Các loài phụ cũng như các kiểu huyết thanh
của Salmonella phân bố không đồng đều trong tự nhiên. Trong khi các loài phụ S.
enterica từ II đến VI là những vi sinh vật hiện diện thường xuyên trong đường ruột
của các loài động vật lưỡng thê và bò sát thì loài phụ S. enterica I thường xuyên
được tìm thấy ở người, động vật máu nóng và chim. Một số kiểu huyết thanh lại chỉ
thích nghi với một ký chủ đặc hiệu như S. pollurum/galinarum chỉ tìm thấy ở gia
cầm và chim, S. typhi chỉ tìm thấy ở người và các loài linh trưởng Một số nghiên
cứu khác cũng đã chỉ ra rằng Salmonella gây bệnh cho người chủ yếu nằm trong
loài phụ S. enterica I.
Mặt khác, các nghiên cứu đã công bố cũng cho thấy S. weltevreden là kiểu
huyết thanh thường xuyên hiện diện trong nước ở các ao hồ nuôi thuỷ sản tại Anh,
Xứ Wales và Úc. Kiểu huyết thanh này cũng thường xuyên được tìm thấy trong các
sông hồ và ao nuôi thuỷ sản ở các nước trong khu vực Đông Nam Á. Nghiên cứu
của Trung tâm Kiểm soát dịch bệnh (CDC) Hoa Kỳ cho thấy kiểu huyết thanh này
hiếm khi được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của người, nghĩa là khả năng gây
bệnh của của kiểu huyết thanh này hầu như không có. Như vậy một số dòng
Salmonella hiện diện thường xuyên trong môi trường tự nhiên là không gây hại cho
con người.
Về khía cạnh vệ sinh an toàn thực phẩm, Salmonella là chỉ tiêu được đặc biệt
quan tâm vì khả năng gây bệnh cho người qua con đường thực phẩm. Tuy nhiên các
nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy rằng không phải tất cả các dòng
Salmonella đều có khả năng gây bệnh cho người, mà chỉ có những dòng có mang
yếu tố gây bệnh và có khả năng chống lại hệ thống phòng vệ của vật chủ thì mới có
khả năng gây bệnh cho người. Mặt dù vậy, yêu cầu về vệ sinh an toàn thực phẩm
của hầu hết các nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella
trong 25g thực phẩm, không phân biệt dòng hay kiểu huyết thanh Salmonella bị
nhiễm có thực sự nguy hiểm cho con người hay không. Trên thực tế các phương
pháp phân tích Salmonella trong thực phẩm hiện nay chỉ xác định đến giống, không
phân loài hay kiểu huyết thanh (Salmonella spp.). Điều này đã gây nhiều khó khăn
và thiệt hại cho các nhà sản xuất và kinh doanh thực phẩm, đặc biệt là ngành thủy
sản.
Các dẫn chứng nêu trên cho thấy cần xem xét lại một cách nghiêm túc quan
niệm cho rằng mọi Salmonella spp. nhiễm vào thực phẩm đều nguy hiểm cho con
người, cũng như cần có phương pháp hữu hiệu để phát hiện phân biệt Salmonella có
khả năng gây bệnh với Salmonella khác trong thực phẩm. Như vậy việc nghiên cứu
xác định sự khác biệt giữa các dòng Salmonella gây bệnh với các dòng Salmonella
vô hại khác, đồng thời thiết lập phương pháp phát hiện phân biệt giữa chúng với
nhau có ý nghĩa rất lớn nhằm cung cấp cơ sở khoa học để xóa bỏ một phần rào cản
về yêu cầu Salmonella trong thực phẩm hiện nay.
Quy trình phân tích Salmonella trong thực phẩm cho đến nay vẫn chủ yếu sử
dụng phương pháp nuôi cấy. Với phương pháp này, thời gian phát hiện là 4 - 6
ngày, tốn nhiều công sức lao động, gây khó khăn trong việc phân tích nhanh các
mẫu thực phẩm nhiễm mầm bệnh và chẩn đoán nguyên nhân gây ngộ độc được nghi
ngờ do Salmonella gây ra. Mặt khác, quy trình phân tích này không cho phép phân
biệt các loài hay loài phụ Salmonella với nhau. Phương pháp PCR (Polymerase
Chain Reaction) được coi là phương pháp có tiềm năng thay thế phương pháp nuôi
cấy trong việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh, trong đó có Salmonella, vì có độ
nhạy và độ đặc hiệu cao. Nhờ vào tính đặc hiệu này, có thể thiết kế quy trình PCR
để phát hiện phân biệt giữa nhóm Salmonella gây bệnh và nhóm không gây bệnh
hiện diện thường trực trong môi trường tự nhiên. Tuy nhiên, để phương pháp PCR
trở thành một phương pháp tiêu chuẩn chính thức có thể dùng thay thế cho phương
pháp nuôi cấy, đang được xem là phương pháp chuẩn hiện nay, thì cần tiến hành
việc xác nhận hiệu lực nhằm khẳng định các thông số kỹ thuật của một phương
pháp PCR là tương đương với phương pháp nuôi cấy. Việc xây dựng được phương
pháp PCR chuẩn như vậy mở đường cho việc đưa phương pháp PCR trở thành tiêu
chuẩn chính thức thay thế phương pháp nuôi cấy còn nhiều nhược điểm nêu trên.
Để góp phần giải quyết các vấn đề nêu ra như trên, mục tiêu của luận án này
nhằm cung cấp thêm cơ sở khoa học và các công cụ ứng dụng cho việc phân biệt
các loài phụ S. enterica I gây bệnh và các loài phụ Salmonella khác, phục vụ công
tác giám sát chỉ tiêu Salmonella trong thực phẩm nói chung và trong thủy sản nói
riêng tại Việt Nam
Để thực hiện được mục tiêu này, trong giới hạn của luận án, các nội dung sau
đây đã được khảo sát, nghiên cứu:
1. Nghiên cứu phương pháp phát hiện Salmonella spp. và loài phụ gây bệnh S. enterica I trong thực phẩm bằng phản ứng PCR.
2. Nghiên cứu so sánh sự hiện diện và biểu hiện các gen gây bệnh của S. enterica I và Salmonella spp.
3. Nghiên cứu so sánh đặc tính gây bệnh của loài phụ S. entrica I với các loài phụ khác
4. Xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella spp. và S. enterica I ứng dụng trong giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm

Trong các nội dung này, nội dung xây dựng quy trình PCR chuẩn phát hiện
Salmonella spp. trong thực phẩm là một bộ phận của đề tài khoa học công nghệ
trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào việc
kiểm tra giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm”, mã số KC.04.30, được thực hiện
trong các năm 2004-2005, do Trường ĐH Khoa học Tự nhiên (ĐH Quốc gia
TP.HCM) làm cơ quan chủ trì, PGS.TS Trần Linh Thước làm chủ nhiệm.

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. 6
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6
1.1. Vị trí phân loại và cách gọi tên Salmonella 7
1.2. Đặc điểm sinh học và tính chất nuôi cấy 10
1.3. Đặc điểm kháng nguyên 11
1.4. Bệnh do Salmonella .12
1.5. Đặc điểm di truyền liên quan đến tính gây bệnh của Salmonella .13
1.5.1. Đặc điểm bộ gen .13
1.5.2. Các cụm gây bệnh 14
1.5.3. Các gen gây độc .15
1.6. Đặc điểm tiến hóa về tính gây bệnh 18
1.6.1. Các bước tiến hóa về tính gây bệnh của giống Salmonella .18
1.6.2. Tiến hoá theo hướng tăng tính gây bệnh .19
1.6.3. Loài phụ S. entreica I tiến hóa theo hướng thích nghi với vật chủ là người và động vật máu nóng .20
1.6.4. Tiến hóa của protein có vai trò bám dính có liên quan đến phổ vật chủ 21
1.7. Sự tương tác giữa Salmonella và vật chủ .22
1.7.1. Cấu tạo của hệ tiêu hóa của người và động vật máu nóng liên quan đến quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn .22
1.7.2. Sự tương tác giữa Salmonella và vật chủ 24
1.7.3. Cơ chế phòng vệ của vật chủ đối với sự xâm nhập của mầm bệnh .25
1.8. Triệu chứng bệnh do Salmonella 28
1.9. Ý nghĩa của việc phân biệt loài phụ S. enterica I với Salmonella spp. trong thực phẩm và thủy sản .29
CHƯƠNG 2. 33
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP .33
2.1. Thiết bị chính 34
2.2. Hoá chất, môi trường 34
2.2.1.Hóa chất 34
2.2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật .36
2.3. Vật liệu thí nghiệm 36
2.3.1. Chủng giống vi sinh vật 36
2.3.2. Chuột sử dụng trong các nghiên cứu 37
2.4. Phương pháp .37
2.4.1. Phương pháp bảo quản chủng vi sinh vật 37
2.4.2. Định lượng mật độ tế bào bằng phương pháp nuôi cấy 38
2.4.3. Phương pháp nuôi cấy để phân lập hoặc phát hiện Salmonella spp. trong
thực phẩm .39
2.4.4. Phương pháp nuôi cấy xác định S. enterica I .42
2.4.5. Phương pháp PCR để phát hiện Salmonella spp., S. enterica I và để khảo
sát sự hiện diện của các gen 44
2.4.6. Thí nghiệm khảo sát lựa chọn gen mục tiêu cho qui trình phát hiện
Salmonella spp. và S. enterica I .47
2.4.7. Khảo sát xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện phân S. enterica I
và Salmonella spp. trong thực phẩm dựa vào hai gen invA và iagAB .47
2.4.8. Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. và S. enterica I trong thực phẩm
bằng phản ứng multiplex PCR 2 cặp mồi nhân bản đồng thời gen mục
tiêu invA và iagAB .48
2.4.9. Phương pháp RT-PCR trong thí nghiệm khảo sát sự biểu hiện của các
gen gây bệnh .48
2.4.10. Phương pháp nghiên cứu khả năng xâm nhiễm và gây bệnh ở chuột .50
2.4.11. Nghiên cứu sự phiên mã in vivo của gen ssrA ở Salmonella sử dụng mô
hình chuột bị gây nhiễm 53
2.4.12. Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình chuẩn phát hiện
Salmonella spp. .53
2.4.13. Xác nhận hiệu lực phương pháp PCR trong phân tích Salmonella spp.
trong thực phẩm 55
CHƯƠNG 3. 59
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 59
3.1. Phân lập định danh Salmonella từ thực phẩm, thủy sản bằng phương
pháp nuôi cấy, sinh hóa, miễn dịch 60
3.2. Nghiên cứu phương pháp phát hiện Salmonella spp. và loài phụ gây
bệnh S. enterica I trong thực phẩm bằng phản ứng PCR .61
3.2.1. Khảo sát khả năng nhân bản sao các gen mục tiêu invA, fimA, iagAB,
spvC ở Salmonella bằng các cặp mồi tương ứng .61
3.2.2. Phát hiện Salmonella spp. bằng phản ứng PCR dựa trên gen mục tiêu
invA .62
3.2.3. Phát hiện loài phụ gây bệnh S. enterica I bằng phản ứng PCR dựa vào
gen mục tiêu iagAB .64
3.2.4. Phát hiện phân biệt Salmonella spp. và S. enterica I bằng phản ứng
multiplex PCR dùng 2 cặp mồi 66
3.2.5. Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. và S. enterica I trong thực phẩm
bằng phản ứng multiplex PCR 2 cặp mồi nhân bản đồng thời gen mục
tiêu invA và iagAB .68
3.3 Nghiên cứu so sánh sự hiện diện và biểu hiện của các gen gây bệnh ở
Salmonella spp. và loài phụ S. enterica I 70
3.3.1. So sánh sự hiện diện các gen gây bệnh ở Salmonella spp. và loài phụ S.
enterica I từ mẫu có nguồn gốc thực phẩm và mẫu có nguồn gốc bệnh
phẩm .70
3.3.2. So sánh mức độ phiên mã của các gen gây bệnh ở Salmonella spp. và
loài phụ S. enterica I trong điều kiện in vitro .73
3.3.3. Khảo sát sự phiên mã in vivo của gen ssrA ở Salmonella sử dụng mô
hình chuột bị gây nhiễm 76
3.4. Nghiên cứu so sánh đặc tính gây bệnh của loài phụ S. enterica I với các
loài phụ khác .78
3.4.1. Khảo sát so sánh tính gây bệnh in vivo của loài phụ S. enterica I với các
loài phụ khác .78
3.4.2. Sự khác biệt về tính kháng các nhân tố phòng vệ của vật chủ .83
3.4.3. Mối quan hệ giữa các gen gây bệnh và độc lực của Salmonella 89
3.5. Xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella spp. và S. enterica I để
ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm 92
3.5.1 Tối ưu hóa quy trình PCR để phát hiện Salmonella spp. trong thực phẩm
dựa vào gen invA .92
3.5.2. Đề xuất quy trình phân tích Salmonella spp. bằng phương pháp PCR dựa
trên gen mục tiêu invA .96
3.5.3. Đánh giá hiệu lực của quy trình PCR để phát hiện Salmonella spp. trong
thực phẩm dựa trên gen mục tiêu invA .98
3.5.4. Đề xuất quy trình PCR để phát hiện Salmonella spp. dựa vào gen mục
tiêu invA thành tiêu chuẩn ngành trong lĩnh vực thủy sản 101
3.6. Xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện phân biệt Salmonella spp.
với S. enterica I trong thực phẩm .101
3.6.1. Tối ưu hóa quy trình multiplex PCR 2 cặp mồi để phát hiện phân biệt
Salmonella spp. với S. enterica I trong thực phẩm dựa vào gen invA và
iagAB 101
3.6.2. Đề xuất quy trình multiplex PCR 2 cặp mồi để phát hiện phân biệt
Salmonella spp. với S. enterica I trong thực phẩm dựa vào gen invA và
iagAB 104
CHƯƠNG 4. 106
KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 106
4.1 Kết luận 107
4.2. Đề nghị .108
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC