Thạc Sĩ Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đến GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc và PGS. TS. Cao Đăng Nguyên đã quan tâm giúp
đỡ và hướng dẫn tận tình.
Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, giảng viên của Phòng thí
nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học,
Đại học Huế; Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học,
Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban
Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Đào tạo Sau
đại học Trường đại học Khoa học; Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường đại học
Khoa học, Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học
Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã có nhiều giúp đỡ quí báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất
để chúng tôi hoàn thành luận án.
Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi
hoàn thành luận án.
Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình
đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành luận án này.
Huế, ngày 15 tháng 02 năm 2014
Tác giả

Võ Châu Tuấn

LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn
trách nhiệm.
Tác giả

Võ Châu Tuấn


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU 1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN .3
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 4
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT .5
1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật .5
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật .6
1.1.2.1. Nuôi cấy callus 6
1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 7
1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào .10
1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào 12
1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn 16
1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC
VẬT NUÔI CẤY IN VITRO .19
1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật .19
1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật 19
1.2.2.1. Nhóm terpene 20
1.2.2.2. Nhóm phenol .20
1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen 20
1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực
vật 21
1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước 21
1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước 25
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN 28
1.3.2. Thành phần hóa học .28
1.3.3. Công dụng .30
1.3.3.1. Công dụng cổ truyền .30
1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học 30
1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen 35
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.37
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .37
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 37
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .38
2.3.1. Nuôi cấy callus 39
2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào .39
2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác .39
2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men 40
2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của tế bào 40
2.3.4. Định lượng tinh dầu .41
2.3.5. Định lượng curcumin .41
2.3.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước 42
2.3.7. Xác định sesquiterpene 42
2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 43
2.3.9. Xử lý thống kê .43
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44
3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN 44
3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC 47
3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy .47
3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 49
3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST .51
3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA 51
3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D 52
3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA .52
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon .54
3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose .54
3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose .56
3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN .59
3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào .59
3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 61
3.3.2.1. Cỡ mẫu 61
3.3.2.2. Tốc độ khuấy .62
3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí .63
3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN .65
3.4.1. Hàm lượng tinh dầu .65
3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số .67
3.4.3. Hàm lượng curcumin .68
3.4.4. Xác định sesquiterpene 73
3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN .77
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .80
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
82
TÀI LIỆU THAM KHẢO 83
PHỤ LỤC
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
BAP : 6-benzylaminopurine
BA : 6-benzyladenine
CIB : centrifugal impeller bioreator
cs : cộng sự
DMSO : dimethyl sulfoxide
ĐC : đối chứng
ĐHST : điều hòa sinh trưởng
HPLC : high performance liquid chromatography
(sắc ký hiệu năng cao áp)
IAA : indoleacetic acid
IBA : indolebutyric acid
Kin : kinetin
L : lít
L-DOPA : L-3,4 -dihydrooxyphenylamine
LPS : lipopolysaccharide
MS : Murashige và Skoog (1962)
NAA : naphthaleneacetic acid
Nxb : nhà xuất bản
TNF-α : tumor necrosis fact