Tiến Sĩ Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC
NĂM 2014
MỤC LỤC MỤC LỤC MỤC LỤC MỤC LỤC MỤC LỤC MỤC LỤC MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU 1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI . 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN . 3
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 4
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT . 5
1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật . 5
1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật . 6
1.1.2.1. Nuôi cấy callus 6
1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 7
1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào . 10
1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào 12
1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn 16
1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT NUÔI CẤY IN VITRO . 19
1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật . 19
1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật 19
1.2.2.1. Nhóm terpene 20
1.2.2.2. Nhóm phenol . 20
1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen 20
1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật 21
1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước 21
1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước 25
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN 28
1.3.2. Thành phần hóa học . 28
1.3.3. Công dụng . 30
1.3.3.1. Công dụng cổ truyền . 30
1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học 30
1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen 35

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 37
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU . 37
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 37
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 38
2.3.1. Nuôi cấy callus 39
2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào . 39
2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác . 39
2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men 40
2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của tế bào 40
2.3.4. Định lượng tinh dầu . 41
2.3.5. Định lượng curcumin . 41
2.3.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước 42
2.3.7. Xác định sesquiterpene 42
2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 43
2.3.9. Xử lý thống kê . 43

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44
3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN 44
3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC 47
3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy . 47
3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 49
3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST . 51
3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA 51
3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D 52
3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA . 52
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon . 54
3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose . 54
3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose . 56
3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN . 59
3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào . 59
3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 61
3.3.2.1. Cỡ mẫu 61
3.3.2.2. Tốc độ khuấy . 62
3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí . 63
3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN . 65
3.4.1. Hàm lượng tinh dầu . 65
3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số . 67
3.4.3. Hàm lượng curcumin . 68
3.4.4. Xác định sesquiterpene 73
3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN . 77
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 80
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 82
TÀI LIỆU THAM KHẢO 83
PHỤ LỤC
MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc các chất phụ gia thực phẩm có giá trị [132]. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây (thường nhỏ hơn 1% khối lượng khô) và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật [177]. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất thứ cấp khác nhau ở thực vật đã đuợc công bố [19], [23].
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo dược làm thuốc để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe. Việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất nhanh chóng do sự biến đổi của khí hậu toàn cầu cũng như sự khai thác bừa bãi của con người. Như vậy, sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật bằng con đường canh tác truyền thống và tổng hợp hóa học sẽ có nhiều hạn chế, khó có thể đáp ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày càng tăng trong tương lai [188]. Điều này buộc các nhà khoa học cần phải tính đến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật như một con đường tiềm năng để cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm [106].
2
Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm 1950. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức có hiệu quả trong sản xuất các hợp chất có hoạt chất sinh học hoặc các chất chuyển hóa của chúng [132]. Ưu điểm của nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu dồi dào để tách chiết ở quy mô công nghiệp các hoạt chất mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên [106]; có thể tạo ra các hợp chất mới và chủ động nâng cao khả năng sản xuất chúng bằng cách thay đổi các điều kiện nuôi cấy [128]; các hoạt chất thu được không bị nhiễm bẩn bởi thuốc trừ sâu, diệt cỏ, kháng côn trùng cũng như tránh được sự không đồng nhất về nguồn nguyên liệu và những biến động hàm lượng của các sản phẩm thực vật ngoài tự nhiên. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học tích lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro tương đương hoặc cao hơn nhiều lần so với cơ quan tích lũy của chúng trong cây ngoài tự nhiên [140], [167]. Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này trên qui mô lớn như anthraquinone ở cây Rubia akane, vincristine ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus), berberin ở cây Coscinium fenustratum, diosgenin ở cây Dioscorea doryophora, taxol ở các loài thuộc chi Taxus, ginsenoside ở các loài thuộc chi Panax [163].
Nghệ đen còn gọi là nga truật thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) có nguồn gốc từ Đông Bắc Ấn Độ, được trồng ở khắp khu vực Nam Á, Đông Nam Á, Trung Quốc, Đài Loan, và Madagasca [9], [115]. Củ của cây nghệ đen có chứa các hoạt chất sinh học chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu. Ngoài ra nó còn có tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng như tannin và flavonoid [82]. Các nghiên cứu cho thấy, curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u; một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng [55], [66], [152]; curcumin cũng có tác dụng chống đông máu và hạ huyết áp; curcuminoid và sesquiterpene là những chất có khả năng ức chế sự hình thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng chống viêm nhiễm [152]; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ tế bào. Nhiều công trình nghiên cứu cũng cho thấy, tinh dầu nghệ đen có tác dụng kháng khuẩn và kháng đột biến rất cao [176]. Bên cạnh đó, polysaccharide của nghệ đen ức chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt (sarcoma 180) được cấy dưới da của chuột, ngăn cản đột biến nhiễm sắc thể, có hoạt tính kích thích đại thực bào [75], [105], [169]. Trong tự nhiên, nghệ đen là loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian dài để tạo củ nên hệ số nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc biệt là phụ thuộc rất lớn vào điều kiện đất đai, khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân công và vật tư sản xuất. Mặt khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc các bệnh như thối củ và đốm lá [29]. Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học quý của cây nghệ đen sử dụng trong bào chế dược phẩm.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng”

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định được khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học một số hợp chất trong tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L.

3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có tính hệ thống về nuôi cấy in vitro tế bào cây nghệ đen và sự tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của luận án là cơ sở khoa học để phát triển hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen ở qui mô lớn nhằm sản xuất nhanh sinh khối, cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn định của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml và trong hệ lên men 10 L.
- Đã khảo sát sự tích lũy các chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu, curcumin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy. Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời điểm tích lũy cao nhất của các hợp chất này theo đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển hóa sinh học các chất như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen.
- Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu chiết rút từ tế bào cây nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả năng ức chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh ở mức tương đương hoặc cao hơn so với tinh dầu chiết rút từ củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên.