Tài liệu Nghiên cứu nhân nhanh giống địa lan Hồng hoàng Sapa (cymbidium iridioides) bằng phương pháp nuôi cấy

Đề tài: Nghiên cứu nhân nhanh giống địa lan Hồng hoàng Sapa (cymbidium iridioides) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

1. Phần 1: Mở đầu1.1. Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển của nền kinh tế. Nghề trồng hoa cây cảnh đă đem lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần chuyển dịch cơ cấu kinh tế nông nghiệp. Sản xuất hoa lan mang lại nhiều lợi nhuận bởi giá trị kinh tế và thẩm mỹ của nó. Nó đă thực sự trở thành sản phẩm chiếm ưu thế trên thị trường, thúc đẩy sản xuất kinh doanh đặc biệt ở các nước như Thái Lan, Singapo, Malaixia . Cïng víi sù ph¸t triÓn cña n̉n kinh tƠ. Ngh̉ trång hoa c©y c¶nh ®· ®em l¹i hiÖu qu¶ kinh tƠ cao, găp phÇn chuyÓn d̃ch c¬ cÊu kinh tƠ n«ng nghiÖp. S¶n xuÊt hoa lan mang l¹i nhỉu lîi nhuËn bëi gi¸ tr̃ kinh tƠ vµ thÈm mü cña nă. Nă ®· thùc sù trë thµnh s¶n phÈm chiƠm ­u thƠ trªn th̃ tr­êng, thóc ®Èy s¶n xuÊt kinh doanh ®Æc biÖt ë c¸c n­íc nh­ Th¸i Lan, Singapo, Malaixia . Ở Thái Lan, kim ngạch xuất khẩu hoa lan cắt cành năm 1991 đạt 30 triệu USD, Singapore mỗi năm thu lợi nhuận từ lan cắt cành 10 triệu USD. Kim ngạch xuất khẩu hoa lan trên thế giới hàng năm đạt 1,8 tỷ USD [13].
Việt Nam là một quốc gia có hệ thống rừng với độ che phủ lớn, khí hậu nhiệt đới Èm gió mùa phù hợp nhu cầu sinh thái của các loài lan. Mặt khác nước ta nằm trong trung tâm khởi nguồn của nhiều loài lan quư, có tiềm năng to lớn nguồn cây dại và quỹ gen phong phú. Các vùng như Sapa, cao nguyên Méc Châu, Ba V́, Đà Lạt . thích hợp cho sự phát triển nhiều loài lan phục vụ công tác chọn tạo giống cây trồng. Tuy nhiên chúng ta c̣n gặp những khó khăn bởi thiên tai diễn biến bất thường, nạn khai thác rừng tràn lan, nhiều loài lan quư có nguy cơ tuyệt chủng, hệ sinh thái tài nguyên ngày càng cạn kiệt.
Địa lan hồng hoàng (Cymbidium iridioides) mặc dù số lượng Ưt nhưng với vẻ đẹp tự nhiên là loài có hoa tự dài nhất, hoa to và bền, màu sắc nâu tím, cánh môi vàng sẫm, số lượng hoa trên chùm có thể lên tới 15,5 hoa, nó đă thực sự thu hót người tiêu dùng trong và ngoài nước. Nhưng khả năng đậu quả trong tự nhiên lại rất thấp. Việc nghiên cứu t́m ra nhân giống in - vitro cho loài địa lan này c̣n chưa được nghiên cứu đầy đủ. Để khôi phục phát triển lan bản địa nhằm bảo tồn nguồn gen phục vụ cho lai tạo lan rừng trong tương lai, tạo ra nhiều loài đặc hữu ở Việt Nam là một vấn đề cấp thiết cần nghiên cứu giải quyết. Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, chúng tôi triển khai nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh giống địa lan Hồng hoàng Sapa (cymbidium iridioides) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”.
1.2. Mục đích yêu cầu đề tài1.2.1. Mục đích Xác định được một số khâu kỹ thuật chính trong quy tŕnh nhân giống địa lan bản địa, trên cơ sở đó xây dựng kỹ thuật trồng nhân giống và công nghệ nhân nhanh giống địa lan bản địa Hồng hoàng Sapa (Cymbidium iridioides)
1.2.2. Yêu cầu của đề tàiGiai đoạn nhân nhanh in - vitro
- Nghiên cứu của việc bổ sung khoai tây vào môi trường đến sự nảy mầm của hạt.
- Nghiên cứu nhân nhanh bằng phương pháp cắt lát mỏng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến chất lượng của chồi
Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
- Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến quá tŕnh ra rễ.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của α - NAA đến quá tŕnh ra rễ.
Giai đoạn sau nuôi cấy in vitro
- Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lư giá thể của cây ở giai đoạn vườn ươm.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp che tối khi cây đưa ra vườn ươm.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây ở giai đoạn vườn ươm.


2. Phần 2. Tổng quan tài liệu2.1. Sơ lược về cây hoa lan2.1.1. Nguồn gốc, vị trí trong hệ thống phân loại thực vật Cây hoa lan Orchidaceae thuộc họ phong lan Orchidaceae, bé lan Orchidales, líp một lá mầm Monocotyledoneae. Cây lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông, theo Bretchacider th́ từ đời vua Thần Nông (2800) trước công nguyên, lan rừng này được dùng làm thuốc chữa bệnh. Sau đó cùng với vẻ đẹp và tác dụng chữa bệnh. Robut Bron (1773 – 1858) là người đầu tiên đă phân biệt rơ ràng giữa họ lan và các họ khác [1, 2, 3, 4, 9, 10, 23]. Joanlind (1979 – 1985) là người đặt nền tảng hiện đại cho môn học về lan. Năm 1836, ông công bố sắp xếp các tông họ lan (A tabuler view of the Tribes of orchidalr) tên của họ lan do ông đưa ra đựơc dùng cho đến ngày nay (Trần Hợp – 1990) [10]. Họ lan có mặt ở hầu hết các vùng trên trái đất, nhưng có khoảng 4/5 tập trung ở những vùng nhiệt đới [20], nó đứng thứ hai sau họ cúc, khoảng 15000-35000 loài, phân bố từ 68 độ vĩ bắc cho đến 56­ vĩ độ nam. Tuy nhiên, phân bố chính của họ này là ở trên các vĩ độ nhiệt đới, đặc biệt là châu Mỹ và Đông Nam Á (Mau – RFL 1983) [23]. Cây lan biết đến đầu tiên ở Trung Hoa là kiến lan, đó là Cymbidium ensifonymum là một loài bán địa lan. Ở châu Âu bắt đầu để ư đến phong lan từ thế kỷ 18 sau Trung Quốc đến hàng chục thế kỷ và cũng nhờ các thuỷ thủ thời bấy giê mà phong lan đă đi khắp các miền của địa cầu, lúc đầu là Vanny sau đó đến Bạch Cập, Hạc ĐƯnh rồi Kiến Lan, lan chính thức gia nhập vào ngành hoa cây cảnh trên thế giới 400 năm nay.
Ở ë Việt Nam, có lẽ người đầu tiên khảo sát về lan ở Việt Nam là Gioalas Noureiro – nhà truyền giáo Bồ Đào Nha, ông đă mô tả cây lan ở Việt Nam lần đầu tiên vào năm 1789 trong cuốn “ Flora cochin chinensis” gọi tên các cây lan trong cuộc hành tŕnh đến Nam phần Việt Nam là Aerides, Phaius vàSarcopodium mà đă được Ben Tham và Hooker ghi lại trong cuốn “Genera plante rum” (1862 – 1883) (Nguyễn Hữu Huy, Phan Ngọc Cấp – 1995) [11], chỉ sau khi người Pháp đến Việt Nam th́ mới có những công tŕnh nghiên cứu được công bố đáng kể là F. Gagne Pain và A. Gui Ilaumin mô tả 70 chi gồm 101 loài cho cả 3 nước Đông Dương trong bé “Thực vật Đông Dương chí” (Flora Genera Indochine) do H. Leconte chủ biên xuất bản từ những năm 1932 – 1934.
2.1.2. Đặc tính thực vật học của địa lan Lan cũng giống Lan c̣ng gièng nh­ các loại thực vật khác, có 6 bộ phận: rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt. theo tác giả Trần Hợp (1990) [10] cây lan được mô tảnh­ sau:
2.1.2.1. Rễ lan Nh́n chung, họ lan bao gồm các cây thân thảo, sống lâu năm, sống ở đất, vách đá vôi sống phụ, sống hoại. Đối với địa lan khi sống ở đất, chúng thường có củ giả, rễ mập, xum xuê phụ (b́ sinh) rễ ḅ dài hay ngắn. Chúng phát triển thân rễ nạc dài, ngắn mập hay mảnh mai (tuỳ thuộc vào từng loài) đưa cơ thể ḅ đi xa hay chụm lại thành các bụi dày. Hệ rễ cũng nhỏ, đan thành búi, ngược lại ở các loài phong lan có kích thước lớn hay trung b́nh, hệ rễ khí sinh phát triển rất phong phú, mọc rất dài và mập, khoẻ, vừa giữ cho cơ thể khỏi bị gió làm lung lay và làm nhiệm vụ hấp thu dinh dưỡng. Nh×n chung, hä lan bao gåm c¸c c©y th©n th¶o, sèng l©u n¨m, sèng ë ®Êt, v¸ch ®¸ v«i sèng phô, sèng ho¹i. §èi víi ®̃a lan khi sèng ë ®Êt, chóng th­êng că cñ gi¶, rÔ mËp, xum xuª phô (b× sinh) rÔ bß dµi hay ng¾n. Chóng ph¸t triÓn th©n rÔ n¹c dµi, ng¾n mËp hay m¶nh mai (tuú thuéc vµo tơng loµi) ®­a c¬ thÓ bß ®i xa hay chôm l¹i thµnh c¸c bôi dµy. HÖ rÔ c̣ng nhá, ®an thµnh bói, ng­îc l¹i ë c¸c loµi phong lan că kƯch th­íc lín hay trung b×nh, hÖ rÔ khƯ sinh ph¸t triÓn rÊt phong phó, mäc rÊt dµi vµ mËp, khoÎ, vơa giư cho c¬ thÓ khái b̃ giă lµm lung lay vµ lµm nhiÖm vô hÊp thu dinh d­́ng. Ở mét số loài lan có thân, lá kém phát triển hệ rễ phát triển dày đặc và kiêm nhiệm luôn cả vai tṛ quang hợp. Rễ có dạng dẹt, ḅ rất dài, màu xanh nh­ lá. Đặc biệt các loài phong lan sống hoại bộ rễ có h́nh dạng, cấu trúc khá độc đáo, có thể dài đến vài chục mét, nó có khảo năng leo ḅ cao.
2.1.2.2. Thân cây Thân rất ngắn hay kéo dài, đôi khi phân nhánh, mang lá hay không mang lá. Theo M.E.Pfizer (1882) [10] phong lan có 2 loại thân, mà đa số thuộc loại sinh trưởng hợp trụ (nhóm không thân). Thân này gồm hệ thống của nhiều nhánh lâu năm, với bộ phận nằm ngang, ḅ dải trên giá thể hay Èn sâu trong ḷng đất. Ngược lại, rất Ưt khi gặp các loài phong lan sinh trưởng đơn trục (nhóm có thân), cơ thể khó có khả năng duy tŕ được tư thế thẳng đứng, nó phải nhờ đến các rễ chống đỡ để vươn cao, ở các loài phong lan sống phụ, có nhiều đoạn ph́nh lớn, tạo thành củ giả. Đó là bộ phận dự trữ nước và chất dinh dưỡng để nuôi cây trong hoàn cảnh khô hạn khi sống bán trên cao. Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp.
2.1.2.3. Lá lan Có thể phân lá lan thành 3 loại: lá đứng, lá nửa đứng, lá cong ṛ. Hầu hết các loại địa lan đều là cây tự dưỡng, là “ xương” chế tạo chất dinh dưỡng bằng quang hợp, do đó nó phát triển rất đầy đủ hệ thống lá. Lá mọc đơn độc, hoặc xếp dày đặc ở gốc, hay xếp cách đề đặn trên thân, trên củ giả. H́nh dáng lá thay đổi từ loại lá mọng nước, nạc, dài h́nh kim, h́nh trụ dài, tiết diện tṛn hay có rănh, đến loại lá h́nh phiến mỏng, dài, những lá dưới sát gốc thường tiêu giảm đi chỉ c̣n những bẹ không có phiến lá hay giảm hẳn thành các vảy. Các loài địa lan có số lá trên nhánh biến động rất lớn: lá trên nhánh Ưt phải kể đến Đông lan (2,6 lá/ nhánh). trong khi đó Bạc lan ( Că thÓ ph©n l¸ lan thµnh 3 lo¹i: l¸ ®øng, l¸ nöa ®øng, l¸ cong ṛ. HÇu hƠt c¸c lo¹i ®̃a lan ®̉u lµ c©y tù d­́ng, lµ “ x­¬ng” chƠ t¹o chÊt dinh d­́ng b»ng quang hîp, do ®ă nă ph¸t triÓn rÊt ®Çy ®ñ hÖ thèng l¸. L¸ mäc ®¬n ®éc, hoÆc xƠp dµy ®Æc ë gèc, hay xƠp c¸ch ®̉ ®Æn trªn th©n, trªn cñ gi¶. H×nh d¸ng l¸ thay ®æi tơ lo¹i l¸ mäng n­íc, n¹c, dµi h×nh kim, h×nh trô dµi, tiƠt diÖn trßn hay că r·nh, ®Ơn lo¹i l¸ h×nh phiƠn máng, dµi, nhưng l¸ d­íi s¸t gèc th­êng tiªu gi¶m ®i chØ cßn nhưng bÑ kh«ng că phiƠn l¸ hay gi¶m h¼n thµnh c¸c v¶y. C¸c loµi ®̃a lan că sè l¸ trªn nh¸nh biƠn ®éng rÊt lín: l¸ trªn nh¸nh Ưt ph¶i kÓ ®Ơn §«ng lan (2,6 l¸/ nh¸nh). trong khi ®ă B¹c lan (Cerythrostylum) có số lá/ nhánh rất lớn (9,1 lá/ nhánh). Độ dày và độ rộng của lá cũng rất khác nhau, lá dài phải kể đến Bích ngọc (Cymbidium dayamum): 1cm. Thanh ngọc (Cymbidiumensifolium) 40- 80 cm.
Về màu sắc, phiến lá thường có màu xanh bóng nh­ các chi Lan kiếm (Cymbidium. SW), chi lan Bầu rượu (Calanthe R.Br), có loài có màu xanh đậmnh­ Hạc Đính Vàng (P. flavum).
2.1.2.4. Hoa lan Cấu tạo của hoa lan phong phú và đa dạng. Ta có thể gặp nhiều loài mà mỗi mùa chỉ có một đoá hoa nở hoặc có nhiều cụm hoa mà mỗi cụm chỉ đơm một bông. Mặc dù muôn h́nh muôn vẻ nhưng nếu ta quan sát hoa của bất kỳ cây lan nào cũng có một tổ chức đồng nhất của hoa mẫu 3 là một kiểu hoa đặc trưng của líp một lá mầm, nhưng đă biến đổi rất nhiều để hoa có đối xứng qua một mặt phẳng. CÊu t¹o cña hoa lan phong phó vµ ®a d¹ng. Ta că thÓ gÆp nhỉu loµi mµ mçi mïa chØ că mét ®o¸ hoa në hoÆc că nhỉu côm hoa mµ mçi côm chØ ®¬m mét b«ng. MÆc dï mu«n h×nh mu«n vÎ nh­ng nƠu ta quan s¸t hoa cña bÊt kú c©y lan nµo c̣ng că mét tæ chøc ®ång nhÊt cña hoa mÉu 3 lµ mét kiÓu hoa ®Æc tr­ng cña líp mét l¸ mÇm, nh­ng ®· biƠn ®æi rÊt nhỉu ®Ó hoa că ®èi xøng qua mét mÆt ph¼ng.
Mầm hoa của địa lan được h́nh thành từ đốt thứ 3, thứ 4 ở gần đáy của các giả hành, hoa đứng thẳng hay cong thường dài và mang nhiều hoa, chồi hoa thường xuất hiện bên dưới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già đâm ra bên ngoài. Thông thường, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần. Chồi hoa thường xuất hiện đồng thời với chồi thân, nhưng chồi hoa no tṛn hơn, c̣n chồi thân hơi dẹp. Các lá đầu tiên ở chồi thân mọc đâm ra hai phía h́nh đuôi cá, c̣n ở chồi hoa các lá bao hoa luôn ôm chặt quanh phát hoa. MÇm hoa cña ®̃a lan ®­îc h×nh thµnh tơ ®èt thø 3, thø 4 ë gÇn ®¸y cña c¸c gi¶ hµnh, hoa ®øng th¼ng hay cong th­êng dµi vµ mang nhỉu hoa, chåi hoa th­êng xuÊt hiÖn bªn d­íi gi¶ hµnh, trong c¸c n¸ch l¸, t¸ch c¸c bÑ giµ ®©m ra bªn ngoµi. Th«ng th­êng, mçi gi¶ hµnh chØ cho hoa mét lÇn. Chåi hoa th­êng xuÊt hiÖn ®ång thêi víi chåi th©n, nh­ng chåi hoa no trßn h¬n, cßn chåi th©n h¬i dÑp. C¸c l¸ ®Çu tiªn ë chåi th©n mäc ®©m ra hai phƯa h×nh ®u«i c¸, cßn ë chåi hoa c¸c l¸ bao hoa lu«n «m chÆt quanh ph¸t hoa.
Cọng phát hoa không phân nhánh, dựng đứng hay buông thơng. Chiều dài của phát hoa từ 10 cm đến hơn 100cm. Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân phiên nhau theo đường xoắn ốc. Búp hoa khi đă đủ lớn bắt đầu dang xa khỏi cọng hoa. Thoạt nh́n hoa Cymbidium có 5 cánh gần giống nhau, thực ra chỉ có 2 cánh hoa ở bên trong, c̣n lại là 3 lá đài ở bên ngoài, có cấu trúc và màu sắc giống cánh hoa. Cánh hoa thứ 3 chuyên hoá thành cánh môi, màu sắc sắc sỡ hơn xẻ thành 3 thuỳ tạo ra dạng nửa h́nh ống. Hai thuỳ bên ôm lấy trụ, thuỳ thứ 3 có dạng bầu hay nhọn tạo thành h́nh đáy thuyền, làm chỗ đậu cho côn trùng khi đến đậu hót mật và thụ phấn cho hoa. Giữa 2 cánh môi có 2 gờ dọc song song màu vàng.Tận cùng bên trong có đĩa mật và đôi khi có tuyến tiết mồ hôi. Hoa Cymbidiumlưỡng tính nhị đực và nhị cái cùng gắn chung trên một trụ nhị, nhuỵ h́nh bán trụ hơi cong về phía trước. Nhị ở trên cùng mang 2 khối phấn màu vàng có gót dính như keo. Khối phấn được đậy bởi một nắp màu trắng ngà rễ mở dời chứa khối phấn của trục hợp nhuỵ cách với muỗm nhuỵ bởi một cái gờ nổi lên. Cấu trúc này trong tự nhiên hoa Cymbidium chỉ thụ phấn được nhờ côn trùng. Sau khi hoa thụ phấn, hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu noăn ph́nh to lên tạo thành quả.
2.1.2.5. Quả lan Quả của cây địa lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-6 đường nứt dọc, có dạng từ quả dài ( Qu¶ cña c©y ®̃a lan thuéc lo¹i qu¶ nang, në ra theo 3-6 ®­êng nøt däc, că d¹ng tơ qu¶ dµi (Vanilla) đến dạng h́nh trụ ngắn ph́nh ở giữa. Khi chín quả nở ra và mảnh vỏ c̣n dính lại với nhau ở phần đỉnh và phía gốc. Ở mét số loài quả chín nở theo 1-2 khía dọc, thậm chí không nứt ra mà hạt chỉ ra khỏi vỏ quả khi vỏ này bị mục nát.
2.1.2.6. Hạt lan Hạt lan rất nhiều nhỏ li ti kích thước hạt vô cùng nhỏ với khối lượng toàn bộ hạt trong một quả bằng 1/10-1/1000 mg trong đó không khí chiếm 76-96% thể tích của quả. Do đó hạt lan hầu như không có khối lượng. Hạt chỉ cấu tạo từ một khối chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ xốp chứa đầy không khí. H¹t lan rÊt nhỉu nhá li ti kƯch th­íc h¹t v« cïng nhá víi khèi l­îng toµn bé h¹t trong mét qu¶ b»ng 1/10-1/1000 mg trong ®ă kh«ng khƯ chiƠm 76-96% thÓ tƯch cña qu¶. Do ®ă h¹t lan hÇu nh­ kh«ng că khèi l­îng. H¹t chØ cÊu t¹o tơ mét khèi ch­a ph©n ho¸, trªn mét m¹ng l­íi nhá xèp chøa ®Çy kh«ng khƯ. Phải trải qua 2-18 tháng hạt mới chín. Phần lớn hạt thường chết v́ khó gặp nấm cộng sinh cần thiết để nảy mần. Do đó hạt nhiều có thể theo giă bay rất xa, nhưng hạt nảy mần thành cây lại hiếm. Chỉ ở trong những khu rừng già Èm ướt, vùng nhiệt đới mới đủ điều kiện cho hạt lan nảy mầm.