Thạc Sĩ Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh học của Rickettsia-like Bacteria (RLB) ở tôm hùm bông (Panulirus or

Luận văn thạc sĩ năm 2011
Đề tài: Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh học của Rickettsia-like Bacteria (RLB) ở tôm hùm bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798)

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .i
Mục lục ii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v
Danh mục các bảng vi
Danh mục các hình vii
MỞ ĐẦU .1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình nghiên cứu Rickettsia trên động vật thủy sản trên thế giới .3
1.1.1. Tình hình nghiên cứu Rickettsia–like organism (RLO) trên cá .3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu RLO trên nhuyễn thể .8
1.1.3. Tình hình nghiên cứu RLO trên giáp xác .12
1.2. Tình hình nghiên cứu Rickettsia trên động vật thủy sản ở Việt Nam 16
1.3. Tổng quan về các phương pháp phát hiện RLB .18
1.3.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng 18
1.3.2. Phương pháp mô bệnh học 18
1.3.3. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) .19
1.3.4. Phương pháp phân lập RLB 20
1.3.5. Phương pháp PCR phát hiện RLB 21
1.3.6. Một số phương pháp phân loại vi sinh vật .23
1.3.6.1. Phân loại theo phương pháp cổ điển .23
1.3.6.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 23
1.3.6.3. Tách dòng và giải trình tự gen 16S rRNA .25
Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27
2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu .27
2.2. Phương pháp nghiên cứu 27
2.2.1. Phương pháp thu mẫu nghiên cứu 27
2.2.1.1 . Phương pháp thu mẫu tại hiện trường .27
2.2.1.2. Phương pháp thu mẫu trong phòng thí nghiệm .28
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy RLB .28
iii
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của RLB .29
2.2.4. Phương pháp PCR xác định RLB 29
2.2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA của RLB 29
2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR 30
2.2.5. Phương pháp PCR nhân đoạn gen 16S rRNA .32
2.2.6. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR 33
2.2.7. Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen 16S rRNA của RLB .34
2.2.7.1. Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pCR TOPO 2.1 .34
2.2.7.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α bằng phương pháp sốc
nhiệt .35
2.2.7.3. Tách plasmid DNA bằng Qiagen Miniprep Kit 35
2.2.7.4. Cắt kiểm tra DNA plasmid bằng EcoRI 36
2.2.7.5. Giải trình trình tự đoạn gen 16S rRNA .37
2.2.8. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 37
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .39
3.1. Kết quả thu mẫu 39
3.1.1. Mẫu tôm hùm bông 39
3.1.2. Mẫu thức ăn 41
3.1.3. Mẫu sinh vật bám xung quanh lồng nuôi tôm hùm .45
3.2. Đặc điểm hình thái và trình tự gen 16S rRNA của chủng RLB trên tôm hùm
bông ở Việt Nam 46
3.2.1. Đặc điểm hình thái của chủng RLB trên tôm hùm bông ở Việt Nam .46
3.2.2. Trình tự gen 16S rRNA của chủng RLB trên tômhùm bông ở Việt Nam 48
3.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 48
3.2.2.2. Kết quả nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB bằng phương pháp PCR .48
3.2.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR chủng RLB1 và RLB2 .49
3.2.2.4. Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pCR TOPO 2.1 .50
3.2.2.5. Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng RLB1 .52
3.3. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên tôm hùm bông và một số loại thức
ăn nuôi tôm bằng phương pháp PCR .53
3.3.1. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên tômhùm bông .53
iv
3.3.2. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên mộtsố loại thức ăn nuôi tôm
và các sinh vật bám xung quanh lồng nuôi tôm .57
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO .60

MỞ ĐẦU
Tôm hùm bông (Panulirus ornatusFabricius, 1798) là một trong những loài hải
đặc sản có giá trị kinh tế của Việt Nam, đặc biệt là các tỉnh miền Trung. Từ năm 1992,
nghề nuôi tôm hùm lồng thương phẩm đã góp phần làm thay da đổi thịt cho các vùng
ven biển thuộc các tỉnh từ Phú Yên đến Bình Thuận. Tuy vậy, một dịch bệnh mà người
dân thường gọi là bệnh sữa (hay bệnh đục thân) xuấthiện vào cuối năm 2006 và bùng
phát thành dịch vào tháng 8, 9 năm 2007 đã gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho người
nuôi tôm.
Bệnh có các dấu hiệu đặc trưng như máu và dịch tiết cơ thể có màu trắng đục
như sữa, cơ của các đốt bụng chuyển từ trắng trong sang trắng đục. Ngoài ra, có một
số con có thêm dấu hiệu các phần phụ và thân tôm chuyển sang màu hồng. Bệnh có
thể gây chết đến 90% lượng tôm nuôi sau 3 – 7 ngày xuất hiện dấu hiệu bệnh lý. Bệnh
thường xuất hiện ở tôm hùm bông 3 tháng tuổi đến 0,8 kg và cả tôm sắp thu hoạch.
Hiện nay, bệnh sữa ở tôm hùm bông vẫn là một thách thức lớn đối với các nhà khoa
học cũng như người nuôi tôm.
Bệnh có các biểu hiện tương tự với bệnh sữa ở tôm hùm bông của Việt Nam là
bệnh sữa ở tôm hùm gai Florida Keys (Panulirus argus), tuy nhiên bệnh chỉ xuất hiện
ở giai đoạn juvenile. Tác nhân được xác định là mộtloại virus không có vỏ bọc, có
dạng hình khối 20 mặt, được đặt tên là virus PaV1 [34]. Bệnh sữa cũng đã được phát
hiện trên loài tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ở Madagasca và vùng Đông Phi. Tác
nhân gây bệnh được xác định là loại vi khuẩn ký sinh nội bào tựa như Rickettsia
(Rickettsia-like bacteria - RLB). Kỹ thuật sinh họcphân tử đã được ứng dụng để phát
hiện loại vi khuẩn này [39].
Ngoài ra, bệnh sữa cũng xuất hiện trên loài cua châu Âu (Carcinus maenas) với
dấu hiệu máu đục như sữa. Bệnh thường xuất hiện vàomùa hè khi nhiệt độ nước tăng
cao. Tác nhân gây bệnh là một loại vi khuẩn gram (-), hình que, không nuôi cấy được
trên các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường. Kết quả phân tích 16S rRNA
của vi khuẩn gây bệnh cho thấy đây là một loại vi khuẩn thuộc nhóm α-proteobacteria,
bộ Ricketsiales [28].
2
Ở Việt Nam, bệnh tôm hùm sữa là một bệnh mới và chưa có nhiều nghiên cứu
về bệnh này. Theo kết quả nghiên cứu của Đỗ Thị Hòavà cộng sự (2009), tác nhân
gây bệnh sữa ở tôm hùm nuôi tại các tỉnh miền Trunglà một loại vi khuẩn gram (-),
cong nhiều, kích thước 1,5 – 2,5 µm, ký sinh nội bào bắt buộc giống với Rickettsia
(Rickettsia-like Bacteria - RLB) [2]. RLB là vi sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc, ký
sinh và nhân lên bên trong nguyên sinh chất của tế bào ký chủ. Hiện vẫn chưa nuôi cấy
được RLB trên các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩnnhân tạo thông thường nên việc
phát hiện chúng gặp nhiều khó khăn. Các loại thức ăn tươi sống nuôi tôm như cá,
nhuyễn thể và giáp xác bị nghi ngờ là các vật chủ mang mầm bệnh.
Xuất phát từ thực tế trên, bằng việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử,
chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh học của Rickettsia-like
Bacteria (RLB) ở tôm hùm bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798)”. Mục tiêu của
đề tài là nhằm xác định đặc điểm hình thái, kích thước của chủng RLB ở tôm hùm
bông và biết được sự phân bố của chúng trong thức ăn nuôi tôm. Nghiên cứu góp phần
làm rõ hơn về tác nhân gây bệnh sữa, vật mang bệnh và đường truyền lan của bệnh sữa
ở tôm hùm. Đây là việc làm mới có ý nghĩa khoa học và thực tế cần được triển khai
nghiên cứu.
Đề tài được thực hiện với các nội dung chính sau:

Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen 16S rRNA của chủng RLB trên
tôm hùm bông nuôi ở Việt Nam.

Điều tra sự phân bố của RLB trên tôm hùm bông nuôi ở Việt Nam và một số
loại thức ăn nuôi tôm.
3
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu Rickettsia trên động vật thủy sản trên thế giới
Rickettsia là một nhóm vi sinh vật có kích thước nhỏ, sống ký sinh nội bào bắt
buộc, tăng trưởng và nhân lên trong tế bào chất củacác tế bào chủ nhân chuẩn (thường
là các tế bào nội mô). Do đó Rickettsia chưa sống được trong môi trường dinh dưỡng
nhân tạo. Rickettsia gây bệnh trên cả người, động vật có xương sống và động vật
không xương sống [16].
Vi sinh vật thuộc bộ Rickettsiales thường đa hình thái, chúng có thể có dạng
hình coccoit, elip, hình que hoặc dạng sợi. Kích thước: 0,3–0,5 x 0,3-2 µm. Chúng
không có khả năng di động, gram (-) và có cấu trúc vách tế bào đặc thù của vi khuẩn,
không roi và chỉ nhân lên bên trong tế bào ký chủ [16].
Rickettsia thường được báo cáo về khả năng gây bệnh trên các loài động vật
thủy sản biến nhiệt như cá biển, đặc biệt là các loài cá di cư để đẻ như cá hồi. Ngoài ra,
chúng cũng đã được tìm thấy trên các đối tượng thủysản ngọt như cá rô phi. Các báo
cáo gần đây cho thấy, có ít nhất 25 loài thân mềm hai mảnh vỏ nước mặn và 12 loài
giáp xác bị nhiễm sinh vật ký sinh nội bào giống Rickettsia (Rickettsia–like organism
– RLO) ở Pháp, Canada, Nhật Bản, Tây Ban Nha, Scotland, Thụy Điển, Singapore,
Malaysia và Mỹ [29].
1.1.1. Tình hình nghiên cứu Rickettsia–like organism (RLO)trên cá
Nghiên cứu đầu tiên về RLO trên cá được thông báo vào năm 1939. Trong
nghiên cứu này, RLO được phát hiện trong tế bào củacá Tetrodon fahakabị bệnh ở
sông Nile, Ai Cập. Các tế bào RLO có dạng hình cầu,đường kính xấp xỉ 0,25 µm
được tìm thấy trong máu và các cơ quan khác của cá khi nhuộm bằng phương pháp
nhuộm Giemsa mà vẫn chưa nuôi cấy được. Đến năm 1975, Ozel và Schwanz-Pfitzner
đã tình cờ nuôi cấy và phát hiện RLO ký sinh nội bào trên cá hồi vân (Oncorhynchus
mykiss) khi nuôi cấy virus bằng phương pháp nuôi cấy tế bào RTG-2 [46]. Tuy vậy,
các nghiên cứu về nhóm vi sinh vật này vẫn còn nhiều hạn chế, vị trí phân loại cũng
như những vấn đề liên quan tới bệnh vẫn chưa được làm sáng tỏ. Do đó, chúng vẫn
không được quan tâm nghiên cứu trong thời gian dài.Không có nghiên cứu nào đề cập
tới đối tượng này cho đến khi Davies phát hiện RLO tồn tại trên cá đàn lia
4
(Callionymus lyra) ở vịnh Cardigan, Wales vào năm 1986. RLO được tìmthấy trong
mô của cá đàn lia trong nghiên cứu mô về bệnh do kýsinh trùng máu gây ra trên loài
cá này [26].
RLO được nghiên cứu nhiều từ năm 1989. Trong năm này, khoảng 1,5 triệu con
cá hồi bạc (Oncorhynchus kisutch) có khối lượng từ 200 g đến 2 kg ở Chile chết không
rõ nguyên nhân. Dịch bệnh này đã làm thất thoát hơn10 triệu USD của người nuôi cá
hồi công nghiệp ở Chile [23]. Tỷ lệ hao hụt do bệnhnày gây ra từ 60% cho đến 90%.
Bệnh thường xuất hiện ở cá hồi bạc (O. kisutch), cá hồi vân (O. mykiss) và cá hồi
Atlantic (Salmo salar) [31]. Do vậy, ban đầu bệnh do RLO gây ra được đặttên là SRS
(Salmonid Rickettsial Septicaemia) [24].
Sau khi dịch bệnh bùng nổ, các nghiên cứu sâu hơn được tập trung nghiên cứu
như phân lập và xác định tác nhân gây bệnh, phát triển kỹ thuật chẩn đoán, kiểm tra
đáp ứng miễn dịch của cá và thử nghiệm với các loạikháng sinh trị bệnh [23].
Trong nghiên cứu về bệnh trên cá hồi bạc nuôi ở vùng biển Chile, RLO được
phân lập bằng cách sử dụng dòng tế bào cá để nuôi cấy. Cũng trong nghiên cứu này,
RLO đã được cảm nhiễm vào cá hồng bạc và được tái phân lập và định danh. Từ đó,
loài Piscirickettsia salmonisthuộc bộ Rickettsiales, họ Rickettsiaceaeđược xem là tác
nhân gây bệnh trên cá hồi ở Chile [31].
Sau khi phân lập RLO trên cá hồi bạc nuôi ở Chile, bệnh truyền nhiễm do
Rickettsia cũng được phát hiện trên cá hồi Atlanticnuôi ở vùng biển Colombia Anh
vào năm 1991. Dấu hiệu bệnh tích của bệnh trên cá hồi Atlantic rất giống với dấu hiệu
của bệnh trên cá hồi bạc ở Chile gây ra bởi RLO [15]. Bệnh cũng đã được báo cáo trên
cá hồi pink (Oncorhynchus gorbuscha) nuôi ở vùng biển Colombia Anh vào những
năm 1970, cá hồi Atlantic nuôi ở Phần Lan, Ireland và Scotland.
Đến năm 1994, RLO đã được tìm thấy trên tất cả các loài cá hồi nước mặn. Tuy
nhiên, tác nhân này đã được phát hiện trên cả các loài cá nước ngọt. Chern và Chao
(1994) đã báo cáo về bệnh do Rickettsia gây ra trêncá rô phi nuôi ở ao nuôi nước mặn
và ngọt ở Đài Loan. Tỷ lệ chết do bệnh này gây ra có thể lên đến 95% [19]. Khoo và
cộng sự (1995) cũng đã phát hiện RLO trên loài cá nước ngọt Panaque suttoninuôi ở
vùng nhiệt đới của Mỹ [37]. Ở Pháp, Comps và cộng sự (1996) đã thông báo về sự tồn

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu trong nước
1. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn
(2003), Áp dụng các kĩ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt
Nam, Nhà xuất bản KH&KT Hà Nội.
2. Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2009), “Tác nhân gây bệnh sữa ở tôm hùm nuôi ở miền
Trung Việt Nam”, Tạp chí Khoa học công nghệ thủy sản, Số 02-03/ 2009.
3. Lê Thanh Hòa (2003), Sinh học phân tử virus Gumboro – nghiên cứu ứng dụng
tại Việt Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
4. Lê Anh Tuấn (2005), “Nguồn lợi “cá tạp” ở biển ViệtNam: thành phần, sản
lượng, các hướng sử dụng chính và tính bền vững khilàm thức ăn trong nuôi
trồng thủy sản”, trong Kỷ yếu Hội thảo toàn quốc vềbảo vệ môi trường và
nguồn lợi thủy sản ngày 14-15/1/2005 tại Hải Phòng,NXB Nông Nghiệp Hà
Nội, trang 379-387.
5. Trung tâm quan trắc, cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản
khu vực miền Trung (2010), Báo cáo nhanh tình hình diễn biến môi trường và
dịch bệnh thủy sản khu vực miền Trung tháng 10 năm 2010.
Tài liệu nước ngoài
5. Alday-Sanz V., Rodger H., Turnbull T., Adams A. and Richards R.H. (1994),
“An immunohistochemical diagnostic test for rickettsial disease”, Journal of
Fish Diseases, 17, pp. 189-191.
6. Almendras F.E. and Fuentealba I.C. (1997), “Salmonid rickettsial septisemia
caused by Piscirickettsia Salmonis: a review”, Diseases of Aquatic Organisms,
29, pp. 137-144.
7. Almendras F.E., Fuentealba I.C., Jones S.R.M., Markham F. and Spangler E.
(1997), “Experimental infection and horizontal transmission of Piscirickettsia
salmonis in freshwater-raised Atlantic salmon Salmo salar L.”, Journal of Fish
Diseases, 20, pp. 409-418.
61
8. Almendras F.E., Jones S.R.M., Fuentealba C. and Wright G.M. (1997), “ In
vitro infection of a cell line from Ictalurus nebulosuswith Piscirickettsia
salmonis”, Canadian Journal of Veterinary Research, 61, pp. 66-68.
9. Athanassopoulou F., Sabatakou O., Groman D. and Prapas T. (1999), “First
incidence of Rickettsia-like infections in culturedseabass (Dicentrarchus
labrax L.) in Greece”, European Association of Fish Pathologists, pp. 72.
10. Bonami JR and Pappalardo R (1980), “Rickettsial infection in marine
crustacea”, Experientia36, pp. 180–181.
11. Bondad-Reantaso et al. (2007), “Pearl oyster health: experiences from the
Philippines, China, the Persian Gulf and the Red Sea”, pp. 111–121.
12. Branson E.J. and Nieto Diaz-Munoz D. (1991), “Description of a new disease
condition occurring in farmed coho salmon Oncorhynchus ksiutch(Walbaum)
in South America”, Journal of Fish Diseases, 14, pp. 147-156.
13. Bravo S. (1994), “Piscirickettsiosis in freshwater”. Bulletin of the European
Fish Pathologist, 14(4), pp. 137-139.
14. Bravo S. and Campos M. (1989), “Sindrome del salmoncoho”, Chile Pesquero,
54, pp. 47-48.
15. Brocklebank J.R., Speare D.J., Armstrong R.D. andEvelyn T.P.T. (1992),
“Septicaemia suspected to be caused by a rickettsia-like agent in farmed
Atlantic salmon”, Canadian Veterinary Journal, 33, 407-408.
16. Buxton A. and Fraser G. (1977), “The Rickettsias” (Chapter 36), Animal
Microbiology, Vol. 2, Blackwell Scientific Publication Ltd., Ox ford, pp. 359-390.
17. Carlos S.J., Thorton J.C., Hackett J.L., Valdes F., Poblete A., Kuzyk M.A. and
Kay W.W. (1997), “Immunodiagnostic tests for Renibacterium samoninarum
and Piscirickettsia salmonis”, VIII
th
International Conference on Diseases of
Fish and Shellfish, Edinburgh, pp. 76.
18. Chen S.C., Wang P.C., Tung M.C., Thompson K.D. andAdams A. (2000), “A
Piscirickettsia salmonis like organism in groupe Epinephelus melanostigmain
Taiwan”, Journal of Fish Diseases, 23, pp. 415-418.
62
19. Chern R.S. and Chao C.B. (1994), “Outbreaks of a disease caused by
rickettsia-like organism in cultured tilapias in Taiwan”, Fish Pathology, 29 (2),
pp. 61-71.
20. Comps M., Raymond J.C. and Plassiart G.N. (1996), “Rickettsia-like organism
infecting juvenile sea-bass Dicentrarchus labrax”, Bulletin of the European
Association of Fish Pathologist, 16(1), pp. 30-33.
21. Corbeil S., Hyatt A.D. and Crane M.St.J. (2005), “Characterisation of an
emerging rickettsia-like organism in Tasmanian farmed Atlantic salmon Salmo
salar”, Diseases of Aquatic Organisms, 64, pp. 37-44.
22. Cusack R., Groman D. and Jones S. (1997), “The first reported rickettsial
infections of Atlantic salmon in Eastern North America”, VIII
th
International
Conference on Diseases of Fish and Shellfish, Edinburgh, pp. 109.
23. Cvitanich J., Garate O. and Smith C.E. (1990), “Etiological agent in a Chilean
Coho disease isolated and confirmed by Koch's postulates”, FHS/AFS
Newsletter, 18(1), pp. 1-2.
24. Cvitanich J.D., Garate O.N. and Smith C.E. (1991),“The isolation of a
rickettsia-like organism causing disease and mortality in Chilean Salmonids and
its confirmation by Koch's postulate”, Journal of Fish Diseases , 14, pp. 121-145.
25. Cvitanich J.D., Garate O.N., Silva P.C., Andrade V.M., Figueroa C.P. and
Smith C.E. (1995), “Isolation of a new rickettsia-like organism from Atlantic
salmon in Chile”, FHS/AFS Newsletter, 23 (3), pp. 1-3.
26. Davies A.J. (1986), “A rickettsia-like organism from dragonets, Callionymus
lyra L. (Teleostei: Callonymidae) in Wales”, Bulletin of the European
Association of Fish Pathologist, 6(4), pp. 103-104.
27. Edgerton B. F., and H. C. Prior (1999), “Description of a hepatopancreatic
rickettsia-like bacteria in the redclaw crayfish, Cherax quadricarinatus”,
Disease of Aquatic Organisms36, pp. 77-80.
28. Fiona Eddy, Adam Powell, Simon Gregory, Linda M. Nunan, Donal V.
Lightner, Paul J. Dyson, Andrew F. Rowley and RobinJ. Shields (2007), “ A
63
novel bacteria disease of the European shore crab, Carcinus maenas, molecular
pathology and epidemiology”, Microbiology153, pp. 2839-2849.
29. Fryer J.L. and Lannan C.N. (1994), “Rickettsial and chlamydial infections of
freshwater and marine fishes,bivalves, and crustaceans”, Zoological Studies, 33
(2), pp. 95-107.
30. Fryer J.L. and Lannan C.N. (1996), “Rickettsial infections of fish”, Annual
Review of Fish Diseases, 6, pp. 3-13.
31. Fryer J.L., Lannan C.N., Garcés L.H., Larenas J.J. and Smith P.A. (1990),
“Isolation of a rickettsiales-like organism from diseased Coho salmon
(Oncorhynchus Kisutch) in Chile”, Fish Pathology, 25(2), pp. 107-114.
32. Gaggero A., Castro H. and Sandino A.M. (1995), “First isolation of
Piscirickettsia salmonis from Coho salmon Oncorhnchus kisutch(Walbaum),
and rainbow trout Oncorhynchus mykiss(Walbaum), during the freshwater
stage life cycle”, Journal of Fish Diseases, 18, pp. 277-279.
33. Garcés L.H., Larenas J.J., Smith P.A., Sandino S.,Lannan C.N. and Fryer J.L.
(1991), “Infectivity of a rickettsia isolated from Coho salmon Oncorhynchus
kisutch”, Diseases of Aquatic Organisms, 11, pp. 93-97.
34. Jeffrey D. Shields, Donald C. Behringer Jr (2004),“ A new pathogenic virus in
the Caribbean spiny lobster Panulirus argusfrom the Florida Keys”, Disease of
Aquatic Organism,59, pp. 109-118.
35. Jesus G.M. Silvia G.A., Ana I.A., Francisco R.V (1999). Use of 16S-23S
ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity. Journal
Microbiol Methods. 36: 55-64.
36. Jingfeng Sun and Xinzhong Wu (2004) “Histology, ultrastructure, and
morphogenesis of a rickettsia-like organism causingdisease in the oyster,
Crassostrea ariakensisGould”, Journal of Invertebrate Pathology, vol. 86, pp.
77-86.