Tiến Sĩ Nghiên cứu một số yếu tố liên quan với lệch bội nhiễm sắc thể của phôi người trước làm tổ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2015
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
Chương 1: TỔNG QUAN 4
1.1 Sự phát triển của phôi trước khi làm tổ 4
1.1.1 Phôi ở giai đoạn tiền nhân. 4
1.1.2. Phôi ở giai đoạn phân chia (ngày 2-3 sau thụ tinh). 4
1.1.3 Phôi dâu (phôi ngày 4) 8
1.1.4 Phôi nang (phôi ngày 5-6). 9
1.1.5 Các phương pháp đánh giá chất lượng phôi. 11
1.2. Hiện tượng lệch bội nhiễm sắc thể của noãn và phôi 14
1.3. Phôi thể khảm. 17
1.4. Các phương pháp phân tích nhiễm sắc thể của noãn và phôi . 18
1.4.1. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescent in situ
hybridization/FISH). 19
1.4.2. Phương pháp lai so sánh bộ gen (comparative genomic
hybridization/CGH). 20
1.4.3. Phương pháp lai so sánh bộ gen dùng chíp DNA (array –
comparative genomic hybridization/a-CGH) 21
1.4.4. Phương pháp phân tích đa hình đơn nucleotide dùng chíp DNA
(array Single Nucleotide Polymorphism /a-SNP). 21
1.4.5. Phương pháp phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase chain
reaction/PCR) 21
1.4.6. Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation
Sequencing/NGS) 22
1.5. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể ở noãn, phôi và một số yếu tố liên quan 22
1.5.1. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể ở noãn. 22
1.5.2. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể ở tiền nhân 22
1.5.3. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể ở phôi ngày 3 23
1.5.4. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể ở phôi nang. 24
1.6. Hiện tượng tự sửa chữa của phôi lệch bội nhiễm sắc thể ngày 3. 25
1.7. Một số yếu tố liên quan đến tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể. 26
1.7.1. Sự phát triển của phôi và tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể 26
1.7.2. Hình thái phôi và tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể 29
1.7.3. Hormon kích thích buồng trứng, sự đáp ứng của buồng trứng
và tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể. 34
1.7.4. Một số nguyên nhân gây vô sinh có liên quan đến tỷ lệ lệch
bội nhiễm sắc thể. 35
1.7.5. Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm ảnh hưởng đến tỷ lệ lệch
bội nhiễm sắc thể. 36
1.7.6. Các cặp nhiễm sắc thể và tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể. 38
1.7.7. Tuổi mẹ và tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể. 39
1.7.8. Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến lệch bội nhiễm sắc thể 40
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41
2.1. Đối tượng nghiên cứu. 41
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn lọc đối tượng. 41
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ. 41
2.1.3. Số lượng đối tượng. 41
2.2. Phương pháp nghiên cứu và thu thập số liệu. 42
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 42
2.2.2. Phương pháp tiến hành và thu thập số liệu 43
2.3. Phương tiện nghiên cứu 48
2.4. Các chỉ số, biến số nghiên cứu 48
2.4.1. Các chỉ số về đặc điểm mẫu nghiên cứu: 48
2.4.2. Các chỉ số về kết quả a-CGH: . 49
2.4.3. Các tiêu chuẩn có liên quan đến nghiên cứu. 49
2.5. Xử lý số liệu. 51
2.6. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu. 53
Chương 3: KẾT QUẢ 54
3.1. Đặc điểm bệnh nhân được xét nghiệm phôi bằng phương pháp a-CGH . 54
3.2. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể ở phôi ngày 3 sau thụ tinh 55
3.2.1. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể và mức độ lệch bội nhiễm sắc thể 55
3.2.2. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể phân bố theo cặp nhiễm sắc thể. 58
3.3. Khả năng tự sửa chữa của phôi ngày 3 bị lệch bội nhiễm sắc thể 59
3.3.1. Khả năng phát triển thành phôi nang của phôi lệch bội nhiễm
sắc thể ngày 3 59
3.3.2. Khả năng tự sửa chữa của phôi ngày 3 bị lệch bội nhiễm sắc thể 59
3.3.3. Mối liên quan giữa khả năng tự sửa chữa của phôi LBNST ngày
3 và tuổi mẹ. 60
3.4. Một số yếu tố liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể qua phân tích
đơn biến 61
3.4.1. Tiền sử sảy thai, điều trị vô sinh và lệch bội nhiễm sắc thể 61
3.4.2. Nguyên nhân vô sinh và lệch bội nhiễm sắc thể. 61
3.4.3. Tuổi mẹ liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể 62
3.4.4. Nồng độ FSH cơ bản của mẹ liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể 62
3.4.5. Tốc độ phát triển và hình thái của phôi ngày 3 và lệch bội
nhiễm sắc thể 63
3.4.6. Tốc độ phát triển thành phôi nang, hình thái của phôi nang và
lệch bội nhiễm sắc thể 69
3.5. Một số yếu tố liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể qua phân tích
đa biến 77
3.5.1. Phân tích đa biến 2 yếu tố: Số lượng phôi bào và tuổi mẹ 77
3.5.2. Phân tích đa biến 2 yếu tố: số lượng phôi bào và sự có mặt mảnh
vụn. 78
3.5.3. Phân tích đa biến 2 yếu tố: độ đồng đều về kích thước phôi bào
và sự có mặt mảnh vụn 79
3.5.4. Phân tích đa biến 3 yếu tố: Số phôi bào, độ đồng đều và sự có
mặt mảnh vụn 80
3.5.5. Phân tích đa biến 3 yếu tố: Số phôi bào, sự có mặt mảnh vụn,
và vị trí mảnh vụn 83
Chương 4: BÀN LUẬN . 89
4.1. Bàn luận về phương pháp phân tích di truyền. 89
4.1.1. Bàn luận về việc sinh thiết phôi. 89
4.1.2. Bàn luận về phương pháp a-CGH 92
4.2. Bàn luận về tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể của phôi ngày 3. 94
4.3. Bàn luận về khả năng tự sửa chữa của phôi lệch bội nhiễm sắc thể 96
4.4. Bàn luận về một số yếu tố liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể
qua phân tích đơn biến 102
4.4.1. Tiền sử điều trị thụ tinh trong ống nghiệm thất bại liên quan đến
lệch bội nhiễm sắc thể 102
4.4.2. Nguyên nhân vô sinh liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể 103
4.4.3. Tuổi mẹ liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể 105
4.4.4. Nồng độ FSH cơ bản liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể 107
4.4.5. Tốc độ phát triển của phôi ngày 3 sau thụ tinh (biểu thị qua
số lượng phôi bào) liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể. 109
4.4.6. Hình thái của phôi ngày 3 liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể. 112
4.4.7. Sự phát triển của phôi từ ngày 3 đến giai đoạn phôi nang liên
quan đến lệch bội nhiễm sắc thể . 116
4.4.8. Mức độ lệch bội nhiễm sắc thể và khả năng hình thành phôi nang 119
4.4.9. Khả năng phát triển thành phôi nang vào ngày 5 và giới tính
của phôi liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể. 119
4.4.10. Chất lượng của phôi nang (biểu thị qua chất lượng của mầm phôi
và nguyên bào lá nuôi) liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể. 121
4.5. Bàn luận về một số yếu tố liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể qua
phân tích đa biến. 122
4.5.1. Hai yếu tố: tuổi mẹ và tốc độ phát triển của phôi vào ngày 3 liên
quan đến lệch bội nhiễm sắc thể . 123
4.5.2. Hai yếu tố: số lượng phôi bào và sự có mặt mảnh vụn liên quan
đến lệch bội nhiễm sắc thể. 124
4.5.3. Hai yếu tố: độ đồng đều về kích thước của phôi bào và sự có
mặt của mảnh vụn có liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể 125
4.5.4. Ba yếu tố: số lượng phôi bào, độ đồng đều và sự có mặt của
mảnh vụn liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể. 126
4.5.5. Ba yếu tố: số lượng phôi bào, sự có mặt mảnh vụn và vị trí
mảnh vụn liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể. 127
KẾT LUẬN 129
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA NGHIÊN CỨU . 131
KIẾN NGHỊ . 132
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO . 133
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (In-Vitro Fertilizaion/ IVF)
đóng một vai trò quan trọng trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản, và ngày càng được
phát triển rộng khắp trên thế giới. Để điều trị thụ tinh trong ống nghiệm đạt
kết quả cao đảm bảo cho ra đời một thế hệ khoẻ mạnh về thể lực, sáng suốt về
tinh thần, góp phần nâng cao chất lượng dân số thì việc nghiên cứu một
phương pháp ưu việt để lựa chọn phôi tốt có bộ nhiễm sắc thể (NST) bình
thường là yêu cầu cấp thiết và thực tiễn.
Hiện nay, việc lựa chọn phôi thường chỉ dựa trên những tiêu chuẩn về
hình thái của phôi như: kích thước và số lượng các phôi bào, số lượng nhân
của phôi bào và tỷ lệ các mảnh vụn tế bào trong phôi [1]. Chúng ta đều biết
rằng đánh giá về hình thái không phản ánh đầy đủ chất lượng thực của phôi,
đã hạn chế đến kết quả điều trị thụ tinh trong ống nghiệm. Nhiều khi phôi có



chỉ số hình thái cao lại không làm tổ được hoặc không tạo ra trẻ khoẻ mạnh,
ngược lại, một số lượng phôi có chỉ số hình thái thấp lại có thể tạo ra em bé
bình thường. Trong nhiều trường hợp, phôi không phát triển và không làm tổ
được hoặc bị sẩy sớm là do phôi bị rối loạn về số lượng nhiễm sắc thể như: vô
nhiễm (thiếu cả hai nhiễm sắc thể tương đồng), đơn nhiễm (thiếu một nhiễm
sắc thể), tam nhiễm (thừa một nhiễm sắc thể). Hiện tượng thiếu, thừa nhiễm
sắc thể nói trên gọi là lệch bội nhiễm sắc thể (LBNST/aneuploidy).
Lệch bội nhiễm sắc thể ở noãn và phôi người thu được trong quá trình
điều trị thụ tinh trong ống nghiệm đã được nêu lên từ lâu và rất nhiều nghiên
cứu cũng đã công nhận là hiện tượng lệch bội nhiễm sắc thể xẩy ra ở giai
đoạn trước khi làm tổ. Rối loạn lệch bội nhiễm sắc thể tăng theo tuổi, hơn một
nửa số noãn thu được của phụ nữ trên bốn mươi tuổi có rối loạn lệch bội
nhiễm sắc thể. Tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể càng tăng trên phôi của các cặp vợ
chồng bị sẩy thai liên tiếp hoặc đã từng điều trị thụ tinh trong ống nghiệm hoặc bơm tinh trùng vào buồng tử cung (IUI/ Intra-Uterine Insemination)
nhiều lần thất bại. Phần lớn các trường hợp, lệch bội nhiễm sắc thể gây ảnh
hưởng đến sự sống và phát triển của phôi. Phôi bị lệch bội nhiễm sắc thể có
thể biểu hiện qua hình thái của phôi.
Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến hình thái của phôi như phôi có nhiều
mảnh vụn tế bào, phôi có kích thước các phôi bào không đồng đều, phôi bào
đa nhân, phôi có số lượng phôi bào không điển hình đều có liên quan đến lệch
bội nhiễm sắc thể [2]. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho rằng mối liên quan
này không chặt chẽ do những giới hạn về mặt kỹ thuật, hoặc chưa có kỹ thuật
kiểm tra toàn bộ nhiễm sắc thể của phôi.
Hầu hết các nghiên cứu cũng như thử nghiệm lâm sàng trước đây chỉ áp
dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH/Fluorescence In Situ
Hybridization) chỉ cho phép kiểm tra một số lượng giới hạn nhiễm sắc thể của
phôi (một số lượng lớn nhiễm sắc thể không được kiểm tra) để suy luận đánh
giá toàn bộ phôi nên tỷ lệ chẩn đoán âm tính giả cao (phôi bị lệch bội nhiễm
sắc thể mà đánh giá là bình thường). Các sai lầm về đánh giá phôi nói trên sẽ
làm cho tỷ lệ phôi chuyển bị lệch bội nhiễm sắc thể cao, làm giảm tỷ lệ có
thai, và quan trọng hơn là cho ra đời những trẻ mang bộ nhiễm sắc thể bất
thường, gây nỗi đau cho gia đình, giảm chất lượng dân số, thêm gánh nặng
cho xã hội.
Trong vài năm gần đây, một số phương pháp xét nghiệm di truyền mới
đã được áp dụng để xét nghiệm toàn bộ 23 cặp nhiễm sắc thể của phôi như
phương pháp lai so sánh bộ gen dùng chíp DNA (a-CGH/array-comparative
genomic hybridization), phương pháp phân tích đa hình đơn dùng chíp DNA
(a-SNP/Single-nucleotide polymorphism), phương pháp phản ứng chuỗi định
lượng (qPCR/quantitative polymerase chain reaction). Nhờ kết hợp những
phương pháp mới này cùng với tiến bộ trong sinh thiết phôi nói chung và sinh thiết phôi ở giai đoạn phôi nang mà các nhà lâm sàng có thể chọn lựa tương
đối chính xác 1-2 phôi có số lượng nhiễm sắc thể bình thường, có khả năng
làm tổ cao để chuyển phôi, góp phần làm tăng tỷ lệ làm tổ, giảm tỷ lệ sảy thai
và đa thai.
Do vậy kỳ vọng của nghiên cứu này là áp dụng một kỹ thuật di truyền
phân tử mới, sử dụng bộ thử chíp DNA gọi là phương pháp lai so sánh bộ gen
(array comparative genomic hybridization/ a-CGH) để phân tích toàn bộ 46
nhiễm sắc thể của phôi, làm cơ sở để khuyến cáo ứng dụng một phương pháp
chọn lọc phôi hữu hiệu, chính xác hơn góp phần làm tăng hiệu quả của kỹ
thuật điều trị thụ tinh trong ống nghiệm, đồng thời có đủ dữ liệu chính xác
hơn để nghiên cứu một số yếu tố liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể, làm cơ
sở để phòng bệnh, dự đoán và tư vấn.
Để đáp ứng được yêu cầu trên, nghiên cứu cần có các mục tiêu sau:
1. Xác định tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể trên 23 đôi nhiễm sắc thể của
phôi ngày 3 sau thụ tinh trong ống nghiệm bằng kỹ thuật lai so sánh
bộ gen (a-CGH) và khả năng tự sửa chữa của phôi ngày 3 bị lệch
bội nhiễm sắc thể khi phát triển thành phôi nang.
2. Nghiên cứu một số yếu tố liên quan với lệch bội nhiễm sắc thể của
phôi ngày 3 trước làm tổ.