Tiến Sĩ Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2015
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1
2. MỤC TIEU CỦA ĐỀ TÀI 3
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 4
A. Ý nghĩa khoa học 4
B. Ý nghĩa thực tế 4
4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC 5
1.1. TẾ BÀO TRỨNG TRÂU 5
1.1.1. Cấu tạo tế bào trứng trâu 5
1.1.2. Thu và phân loại chất lượng tế bào trứng trâu 7
1.1.2.1. Thu và đánh giá số lượng tế bào trứng trâu/buồng trứng 8
1.1.2.2. Đánh giá và phân loại chất lượng trứng trâu 9
1.2. MÔI TRƯỜNG NUÔI THÀNH THỤC IN VITRO TẾ BÀO TRỨNG TRÂU 10
1.3. QUÁ TRÌNH THÀNH THỤC NHÂN CỦA TẾ BÀO TRỨNG TRÂU 11
1.4. CHẤT BẢO VỆ LẠNH SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH – GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO TRỨNG 12
1.4.1. Các dạng chất bảo vệ lạnh 12
1.4.2. Cơ chế hoạt động của các chất bảo vệ lạnh 13
1.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến tế bào trứng 19
1.4.4. Ảnh hưởng của thời gian và cách thức tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến tế bào trứng 20
1.4.5. Quá trình giải đông và pha loãng 21
1.5. PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH TẾ BÀO TRỨNG 22
1.5.1. Bảo quản lạnh tế bào trứng 22
1.5.2. Sử khử nước (Dehydration) trong quá trình đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy 25
1.5.3. Quá trình cần bằng 26
1.5.4. Tốc độ đông lạnh 26
1.5.5. Phương pháp đông lạnh 28
1.5.5.1. Đông lạnh chậm (Slow-freezing) 28
1.5.5.2. Thủy tinh hóa (Vitrification) 32
a. Thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống 34
b. Đông lạnh cực nhanh (ultra rapid freezing) 35
1.6. ẢNH HƯỞNG CỦA GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN ĐẾN HIỆU QUẢ BẢO QUẢN LẠNH TẾ BÀO TRỨNG 39
1.6.1. Bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn túi mầm (GV) hoặc giai đoạn chưa thành thục 40
1.6.2. Bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn thành thục nhân (MII) 41
1.7. MỘT SỐ DẠNG TỔN THƯƠNG LẠNH CỦA TẾ BÀO TRỨNG TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH . 43
1.8. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TẾ BÀO TRỨNG SAU BẢO QUẢN LẠNH 44
1.8.1. Đánh giá chất lượng trứng dựa vào quan sát hình thái và nhuộm tế bào . 44
1.8.2. Đánh giá chất lượng dựa vào khả năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng 46
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 48
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu . 48
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu . 48
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 48
2.1.2.1. Thiết bị . 48
2.1.2.2. Hóa chất, dụng cụ . 48
2.2. Nội dung nghiên cứu 49
2.3. Phương pháp nghiên cứu 49
2.3.1. Phương pháp thu buồng trứng trâu . 49
2.3.2. Phương pháp thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ 49
2.3.3. Phân loại tế bào trứng . 50
2.3.4. Phương pháp nhuộm nhân xác định giai đoạn phát triển của nhân tế bào trứng trâu . 50
2.3.5. Phương pháp nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu . 50
2.3.6. Phương pháp đánh giá tế bào trứng trâu thành thục sau nuôi in vitro 50
2.3.7. Phương pháp tạo phôi trâu in vitro . 51
2.3.7.1. Hoạt hóa tinh trùng . 51
2.3.7.2. Thụ tinh in vitro tế bào trứng trâu 51
2.3.7.3. Nuôi phôi in vitro . 51
2.3.8. Phương pháp đông lạnh tế bào trứng 52
2.3.8.1. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ truyền thống . 52
2.3.8.2. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ hở . 52
2.3.8.3. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng bằng vi giọt . 52
2.3.9. Phương pháp giải đông tế bào trứng sau bảo quản lạnh . 52
2.3.10. Phương pháp đánh giá hình thái trứng trâu sau đông lạnh-giải đông . 53
2.4. Thiết kế thí nghiệm 53
2.5. Phân tích số liệu và xử lý thống kê 56
2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 56
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57
3.1. Kết quả thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng ở lò mổ 57
3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu 59
3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sự thành thục in vitro tế bào trứng trâu 61
3.2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến khả năng tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu 63
3.3. Trạng thái của nhân tế bào trứng trâu đầm lầy tại các thời gian nuôi in vitro khác nhau 66
3.4. Ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu . 70
3.4.1. Ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh trứng trâu . 71
3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu . 74
3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu . 78
3.4.4. Ảnh hưởng của sucrose trong quá trình giải đông đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu . 80
3.5. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu . 85
3.5.1. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến số lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh –giải đông . 88
3.5.2. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến chất lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh – giải đông 91
3.5.3. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông . 94
3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu 101
3.6.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến chất lượng tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông . 103
3.6.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến khả năng thành thục in vitro của tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông 105
3.6.3. Khả năng phát triển in vitro tiếp theo của tế bào trứng trâu (được thủy tinh hóa tại một số thời điểm nuôi khác nhau) sau đông lạnh - giải đông 107
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ . 114
4.1. Kết luận 114
4.2. Đề nghị . 114
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 116
TÀI LIỆU THAM KHẢO 117
Tài liệu tham khảo tiếng Việt 117
Tài liệu tham khảo tiếng Anh 117
PHỤ LỤC 144
MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Trâu là một loài động vật có vai trò kinh tế quan trọng ở một số nước châu Á và Địa Trung Hải, trong đó châu Á chiếm 95% sản phẩm từ trâu trên thế giới. Chúng là nguồn cung cấp thịt, sữa, sức kéo trong sản xuất nông nghiệp. Một vài tổ chức trên thế giới đã nhấn mạnh tiềm năng của con trâu trong nền kinh tế nông nghiệp của một số quốc gia đang phát triển ở Châu Á do trâu có hiệu quả hơn so với các gia súc khác trong môi trường nuôi khắc nghiệt. Tuy nhiên con trâu vẫn thực sự chưa được chú ý để khai thác tốt tiềm năng này. Trâu cung cấp nguồn sức kéo quan trọng đối với nông nghiệp và nông thôn đặc biệt là ở vùng sâu, đồi núi, ruộng bậc thang nơi khó triển khai thiết bị cơ giới. Chúng có thể cày kéo ở tất cả địa hình như: ruộng nước, ruộng bậc thang, kéo gỗ trong rừng hoặc dưới suối. Bên cạnh việc cung cấp sức kéo, trâu còn là nguồn cung cấp thịt và sữa hoặc là nguồn thức ăn dự trữ cho những lúc khó khăn, nguy cấp; tuy nhiên do khẩu vị của người tiêu dùng chưa quen với sản phẩm này nên sữa trâu chưa trở thành hàng hóa chính. Do đó hiện nay so với một số ngành chăn nuôi khác như bò, lợn, gà thì chăn nuôi trâu vẫn chưa được quan tâm phát triển đúng mức.
Theo số liệu thống kê của Tổng Cục Thống kê và Cục Chăn nuôi Việt Nam, số lượng trâu trên cả nước ta đang có xu hướng giảm dần (Bảng 1 – Phụ lục), chính vì thế cần phải cải thiện khả năng sinh sản của đàn trâu để tránh hiện tượng suy giảm đàn trâu, ảnh hưởng tới nguồn gen quý. Tuy nhiên, chi phí giống cao và các vấn đề về sinh sản như biểu hiện động dục không rõ ràng, tỷ lệ động dục thầm lặng cao (Esposito và cs., 1992; Zicarelli và cs., 1997), khoảng cách giữa các lứa đẻ dài, sự thành thục về tính muộn, ít các nang trứng non, số tế bào trứng tốt/buồng trứng thấp, quá trình sinh sản bị ảnh hưởng bởi mùa vụ (Le Van Ty và cs., 1994) và tỷ lệ thụ thai thấp đã hạn chế sự phát triển của đàn trâu. Sự thành công của chăn nuôi trâu phụ thuộc vào việc cải thiện di truyền mà điều này có thể đạt được bằng cách ứng dụng công nghệ sinh học sinh sản. Mặc dù công nghệ sinh học sinh sản đã được nghiên cứu và áp dụng ở loài động vật đặc biệt này nhưng hầu hết chúng không đạt hiệu quả như đối với bò, một loài động vật có rất nhiều nét tương đồng. Tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng trâu ở lò mổ là nguồn nguyên liệu chính được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng cho các thí nghiệm nghiên cứu về công nghệ sinh học sinh sản trên trâu như: cấy chuyển nhân tế bào soma (SCNT), thụ tinh in vitro (IVF) và vi tiêm tinh trùng (ICSI) (Parnpai và cs., 2014). Nhưng nguồn mẫu tế bào trứng trâu này khá ít và không ổn định, số lượng tế bào trứng tốt thu được trên một buồng trứng trâu thường ít hơn khi so sánh với một số loài vật nuôi khác (bò, lợn). Chính vì vậy việc tạo ra một nguồn nguyên liệu trứng trâu có chất lượng tốt và chủ động là một giải pháp mà các nhà khoa học trên thế giới đang nghiên cứu và quan tâm.
Bảo quản lạnh là bước đột phá quan trọng trong khoa học bởi vì đó là một trong các phương pháp khá hiệu quả được sử dụng để bảo tồn sự đa dạng di truyền động vật, trong đó có cả những loài động vật có nguy cơ tuyệt chủng. Việc bảo quản lạnh thành công tế bào trứng trâu có ý nghĩa rất quan trọng, nó góp phần gìn giữ nguồn gen những giống trâu quý, đồng thời đó là nguồn nguyên liệu giúp các nhà khoa học có thể sử dụng cho các thí nghiệm nghiên cứu về sinh sản hay về phôi sinh học của mình. Trên thế giới vấn đề bảo quản lạnh tế bào trứng được nghiên cứu ở trên một số loài động vật từ khá lâu và đã tạo ra được con non từ tế bào trứng sau đông lạnh-giải đông (Fuku và cs., 1992, Otoi và cs., 1993). Mặc dù hiện nay quy trình đông lạnh phôi và tinh trùng đã trở nên phổ biến, nhưng quy trình đông lạnh tế bào trứng vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Vẫn có một số sai sót xảy ra trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng làm giảm hiệu quả của quá trình này (Leibo, 2008). Quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đến nay vẫn là vấn đề còn bỏ ngỏ do hiệu quả chưa đạt được như mong muốn. Vấn đề chính đối với bảo quản lạnh tế bào trứng trâu là tỷ lệ sống và khả năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông không cao. Nguyên nhân là do tế bào trứng trâu có hàm lượng lipid nội bào cao, độ nhạy cảm với những tổn thương lạnh lớn (Boni và cs., 1992). Sự thành công của quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: chất bảo vệ lạnh, phương pháp đông lạnh, giai đoạn thành thục của tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng.
Tại Việt Nam trước đây có rất ít các nghiên cứu cơ bản về con trâu; có thể do sữa trâu chưa phải là thực phẩm hàng hóa chính; chủ yếu chỉ sử dụng trâu làm sức kéo trong sản xuất nông nghiệp. Tuy nhiên gần đây trâu được coi là đối tượng chăn nuôi tạo thực phẩm và cho sức kéo nên các nhà khoa học cũng đã quan tâm đến vấn đề ứng dụng công nghệ sinh học trong việc nâng cao khả năng sinh sản và đặc điểm sinh lý sinh sản của trâu nhằm bảo tồn những giống trâu quý. Luận án này được thực hiện trong điều kiện bảo quản lạnh tế bào trứng là một lĩnh vực nghiên cứu còn rất mới và ít được quan tâm ở Việt Nam, đặc biệt là đông lạnh tế bào trứng trâu thì chưa có báo cáo nào.
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
- Đánh giá ảnh hưởng của một số chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis).
- Đánh giá ảnh hưởng của một số phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis).
- Đánh giá ảnh hưởng của giai đoạn nuôi thành thục in vitro đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis).


3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
A. Ý nghĩa khoa học
- Lựa chọn được chất bảo vệ lạnh, phương pháp đông lạnh hiệu quả đối với quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu.
- Xác định được giai đoạn nuôi thành thục in vitro mang lại hiệu quả cao cho quá trình đông lạnh tế bào trứng.
- Bước đầu tạo được phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông và tinh trùng đông lạnh.



- Đưa ra được phương pháp bảo quản lạnh thành công tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis) tại Việt Nam.
B. Ý nghĩa thực tế
- Sự thành công trong việc bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis) đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học lạnh đối với việc bảo tồn các loài động vật nuôi có giá trị kinh tế cao, các loại động vật nuôi quý hiếm tại Việt Nam dưới dạng tế bào trứng đông lạnh.
- Nguồn tế bào trứng trâu đông lạnh là nguồn nguyên liệu sử dụng cho các nghiên cứu khác về trâu như: tạo phôi trâu in vitro; tạo phôi trâu nhân bản bằng cấy chuyển gen, cấy chuyển nhân.
4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Lần đầu tiên tại Việt Nam đưa ra phương pháp đông lạnh thành công tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis).
- Lần đầu tiên tại Việt Nam tạo được phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu (Bubalus bubalis) sau đông lạnh-giải đông.
- Các kết quả nghiên cứu của luận án này có thể ứng dụng cho các phòng thí nghiệm về Công nghệ sinh sản trên toàn quốc