Tiến Sĩ Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytri

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NĂM 2014
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU1
Chương I.TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3
1.1. Hệ thống phân loại, các kĩ thuật phân lập và định tên chi Schizochytrium 3
1.1.1. Hệ thống phân loại 3
1.1.2. Kĩ thuật phân lập và định tên 6
1.1.2.1. Kĩ thuật phân lập 6
1.1.2.2. Các kĩ thuật định tên 7
1.2. Các axít béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 (-3 PUFA) 8
1.2.1. Giới thiệu chung về -3 PUFA 8
1.2.2. Vai trò của -3 PUFA đối với sức khoẻ con người 9
1.2.3. Sản xuất ω-3 PUFA từ vi tảo 12
1.3. Đặc điểm sinh học của chi Schizochytrium 14
1.3.1. Đặc điểm sinh thái 14
1.3.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố lên sinh trưởng, tích lũy lipit và -3 PUFA ở Schizochytrium 14
1.3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn C và N 14
1.3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối 16
1.3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ 17
1.3.3. Con đường sinh tổng hợp DHA ở chi Schizochytrium 20
1.4. Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng nói chung và chi Schizochytrium nói riêng cho sản xuất -3 PUFA 23
1.4.1. Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng cho sản xuất -3 PUFA 23
1.4.2. Sản xuất DHA ở quy mô lớn ở chi Schizochytrium 25
1.5. Những ứng dụng sinh khối của chi Schizochytrium 27
1.5.1. Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản 27
1.5.2. Sản xuất thức ăn cho gia súc, gia cầm 31
1.5.3. Sản xuất dầu sinh học giàu omega-3 32
1.5.4. Sản xuất nhiên liệu sinh học 33
1.6. Tình hình nghiên cứu vi tảo biển dị dưỡng ở Việt Nam 34
Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37
2.1. Vật liệu 37
2.1.1. Mẫu vật 37
2.1.2. Vi sinh vật 37
2.1.3. Các bộ sinh phẩm 37
2.1.4. Động vật thí nghiệm 37
2.2. Hoá chất 38
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 38
2.4. Môi trường 39
2.5. Phương pháp nghiên cứu 40
2.5.1. Phân lập chi Schizochytrium 40
2.5.2. Chụp ảnh hình thái tế bào dưới kínhhiển vi điện tử quét (SEM) 40
2.5.3. Các phương pháp sinh học phân tử 41
2.5.3.1. Tách chiết DNA tổng số từ các chủng Schizochytrium spp. 41
2.5.3.2. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 41
2.5.3.3. Tinh sạch sản phẩm PCR 42
2.5.3.4. Tách dòng gen 42
2.5.3.5. Xác định trình tự gen 44
2.5.4. Xác định sinh trưởng của các chủng Schizochytrium spp.44
2.5.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng Schizochytrium spp. 45
2.5.6. Xác định hàm lượng lipít trong sinh khối tảo 45
2.5.7. Phân tích thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh khối Schizochytrium spp. 46
2.5.8. Phương pháp nhuộm lipít b ng ile ed 46
2.5.9. Phương pháp xác định đường khử b ng DNSA 46
2.5.10. Nghiên cứu tính an toàn viên Algal Omega -3 47
2.5.10.1. Nghiên cứu độc tính cấp của Algal Omega -3 47
2.5.10.2. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn 47
2.5.11. Nghiên cứu hiệu lực của chế phẩm Algal Omega- 3 49
2.5.11.1. Xác định phản xạ tìm kiếm thức ăn trong mê lộ 49
2.5.11.2. Nghiên cứu trên mô hình phản xạ tránh shock chủ động có điều kiện 49
2.5.11.3. Nghiên cứu trên mô hình gây suy giảm năng lực tâm thần kinh 51
2.5.12. Nghiên cứu sử dụng sinh khối tảo S. mangrovei PQ6 làm giàu luân trùng (Brachionus plicatilis) và Artemia 51
2.5.12.1. Xác định lượng tảo và thời gian làm giàu thích hợp cho luân trùng và Artemia 51
2.5.12.2. So sánh việc sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 tươi, khô và chất cường hoá Golden Power trong việc làm giàu Artemia 52
2.5.12.3. So sánh việc sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 tươi, men bánh mì và vi tảo biển quang tự dưỡng 52
2.5.12.4. Sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 làm giàu Artemia làm thức ăn cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) 53
2.5.12.5. Nghiên cứu sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 làm giàu Artemia làm thức ăn cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775) 56
2.6. Xử lý số liệu 57

Chương III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58
3.1. Đặc điểm sinh học của các đại diện thuộc chi vi tảo biển Schizochytrium 58
3.1.1. Phân lập các chủng Schizochytrium spp. từ các mẫu lá cây thu thập ở vùng rừng ngập mặn ở Việt Nam 58
3.1.2. Tuyển chọn một số chủng thuộc chi Schizochytrium tiềm năng cho việc sản xuất DHA 59
3.1.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản của một số chủng thuộc chi Schizochytrium tiềm năng 61
3.1.3.1. Một số đặc điểm hình thái điển hình 61
3.1.3.2. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng tiềm năng 63
3.1.3.3. Phân tích hàm lượng lipít, axít béo tổng số và DHA của các chủng tiềm năng 68
3.1.3.4. Bảo quản giống 70 3.1.4. Phân loại các chủng tiềm năng 72
3.1.4.1.So sánh một số đặc điểm hình thái của các chủng tuyển chọn với một số loài đại diện thuộc chi Schizochytrium 72
3.1.4.2. Phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa 18S rRNA 74
3.2. Công nghệ nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong các hệ thống lên men 79
3.2.1. Sinh trưởng chủng PQ6 trong bình lên men 5 và 10 lít 79
3.2.2. Sinh trưởng chủng PQ6 trong bình lên men 30 lít tự tạo 83
3.2.3. Xây dựng quy trình nuôi trồng chủng PQ6 trong bình lên men 30 lít tự tạo 87
3.2.4. Phân tích thành phần dinh dưỡng sinh khối vi tảo thu được 89
3.3. Bước đầu sử dụng sinh khối chủng PQ6 trong sản xuất viên thực phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản 90
3.3.1. Sản xuất viên Algal Omega- 3 từ sinh khối khô chủng PQ6 90
3.3.1.1. Quy trình tạo viên Algal Omega-3 90
3.3.1.2. Nghiên cứu tính an toàn và hiệu lực của viên Algal Omega-3 (AO-3) 93
3.3.2. Ứng dụng sinh khối chủng PQ6 trong nuôi trồng thủy sản 102
3.3.2.1. Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm giàu Artemia và luân trùng (Brachionus plicatilis) 102
3.3.2.2. Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu Artemia làm thức ăn sống cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775) 117
3.3.2.3. Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu luân trùng và Artemia làm thức ăn sống cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) 119


Chương IV. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 121
4.1. Đặc điểm sinh học của các chủng Schizochytrium đã phân lập 121
4.2. Nuôi trồng chủng tiềm năng PQ6 ở các hệ thống lên men 127
4.3. Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm thực phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản 135

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 139
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ 142
TÀI LIỆU THAM KHẢO 143
PHỤ LỤC
MỞ ĐẦU
Được coi là nền công nghiệp mang lại hàng tỷ đô la hàng năm, công nghệ sinh học vi tảo ngày càng mở ra nhiều lĩnh vực nghiên cứu mới. Mặc dù vậy, việc sử dụng vi tảo nhằm tăng cường giá trị dinh dưỡng của thực phẩm cho con người và thức ăn cho động vật vẫn là những lĩnh vực chiếm ưu thế, mang lại lợi nhuận cao và có một lịch sử phát triển tương đối lâu dài.
Schizochytrium là một chi vi tảo biển dị dưỡng phân bố rộng rãi trong hệ sinh thái biển và rừng ngập mặn. Chúng đóng vai trò là những sinh vật phân huỷ, mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn ở những hệ sinh thái nói trên. Loại vi tảo này có khả năng tích lũy hàm lượng cao lipit (có thể lên tới 70% khối lượng khô) và các axít béo không bão hoà thuộc nhóm omega-3 (-3 PUFA) như axít eicosapentaenoic (EPA, C20: 5-3), axít docosahexaenoic (DHA, C22: 6-3). Những tác động tích cực cũng như tầm quan trọng của các -3 PUFA này đã được chứng minh ở nhiều khía cạnh như sự phát triển toàn diện của trẻ nhỏ, sức khỏe đối với hệ tim mạch, hệ thần kinh, và trong nhiều liệu pháp điều trị các bệnh ung thư, mất trí nhớ, trầm cảm . Hiện nay, loại vi tảo này được coi là ứng cử viên tiềm năng thay thế nguồn sản xuất -3 PUFA truyền thống từ dầu cá. Việc nuôi cấy chúng có thể được thực hiện ở quy mô lớn bằng những hệ thống lên men thông thường với hiệu quả cao. Nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ loại vi tảo này dành cho con người, và động vật đã có mặt trên thị trường quốc tế và dần trở nên quen thuộc với người tiêu dùng ở khắp nơi trên thế giới.
Việt Nam đang sở hữu một khu hệ động thực vật biển rất đa dạng về thành phần loài/chủng và giàu các hợp chất tự nhiên có thể dùng trong công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp, y dược trong đó có vi tảo. Vi tảo biển quang tự dưỡng là một trong những đối tượng truyền thống đã được các nhà nghiên cứu trong nước quan tâm cho nhiều mục đích khác nhau trong đó có nuôi trồng thuỷ sản (Nannochloropsis, Isochrysis, Chaetoceros ). Tuy nhiên, những nghiên cứu nhằm khai thác và ứng dụng các chi vi tảo biển dị dưỡng, đặc biệt là chi Schizochytrium vẫn còn là rất mới, hứa hẹn sẽ mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống con
2
người. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6”.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
 Có được bộ sưu tập chủng vi tảo biển dị dưỡng thuộc chi Schizochytrium phân lập từ một số vùng biển, vùng rừng ngập mặn của Việt Nam và sàng lọc các chủng tiềm năng cho việc sản xuất -3 PUFA.
 Lựa chọn được một chủng tiềm năng để nuôi thu sinh khối tạo viên thực phẩm chức năng và thử nghiệm trên một số đối tượng thuỷ hải sản.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
 Phân lập các chủng Schizochytrium spp. từ các mẫu lá cây thu thập ở ven bờ biển, vùng rừng ngập mặn ở Việt Nam;
 Nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản của một số chủng tiềm năng đã phân lập;
 Nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong các hệ thống lên men khác nhau (5, 10 và 30 lít);
 Sản xuất viên Algal Omega- 3 từ sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6, đánh giá tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm này trên động vật thực nghiệm;
 Sử dụng sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6 làm giàu Artemia và luân trùng (Brachionus plicatilis) để ương nuôi ấu trùng cua xanh (Scylla serrate Forskal, 1775) và cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790).
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
 Bổ sung thêm chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mới vào danh sách các chi vi tảo biển có nguồn gốc từ Việt Nam;
 Có được những dẫn liệu khoa học về các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của một số loài/chủng tiềm năng thuộc chi Schizochytrium đã được phân lập;
 Chứng minh được khả năng ứng dụng chủng vi tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 trong lĩnh vực sản xuất thực phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản.