Tiến Sĩ Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và di truyền của heo rừng Tây Nguyên

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi xin trân trọng cảm ơn:
PGS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn và Cố PGS.TS. Bùi Văn Lai, đã hướng dẫn khoa
học, chỉ bảo kinh nghiệm quý báu, tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập
và nghiên cứu để hoàn thành luận án.
Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên và Viện Sinh học
Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như
quá trình thực hiện đề tài này.
Các anh, chị, em đồng nghiệp tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên đã
luôn đồng hành và tạo mọi điều kiện thuận lợi.
TS. Lê Thành Long và các anh chị em phòng Công nghệ sinh học động vật,
Viện Sinh học nhiệt đới đã cùng thực hiện các nghiên cứu và công bố.
Bố, Mẹ, Chồng, con và toàn thể thành viên trong gia đình luôn là nguồn
động viên, an ủi, giúp đỡ và dành những tình cảm thiêng liêng nhất.
Đề tài thuộc Chương trình Tây Nguyên 3 mã số TN3/C06 và các đề tài cấp
cơ sở Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên đã hỗ trợ kinh phí thực hiện các
nghiên cứu.
Đà Lạt, ngày tháng năm 2017
Tác giả luận án



Nguyễn Thị Phương Mai iii

MỤC LỤC

PHẦN MỞ ĐẦU . 1
1. ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 1
3. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 2
4. TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI . 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu về heo rừng . 3
1.1.1. Vị trí phân loại 3
1.1.2. Sự phân bố của heo rừng . 4
1.1.3. Đặc điểm chung của heo rừng . 6
1.1.4. Phương thức tìm kiếm thức ăn 7
1.1.5. Phạm vi sống và mật độ quần thể của heo rừng 8
1.1.6. Đặc điểm của heo rừng Việt Nam . 11
1.2. Tiến hóa và phát sinh loài 12
1.2.1. Chọn lọc nhân tạo trong tiến hóa 12
1.2.2. Phát sinh loài và tiến hóa 13
1.2.3. Các khái niệm về phát sinh loài 15
1.3. Một số marker phân tử . 18
1.3.1. ADN ty thể (mtADN) 18
1.3.2. Gen cytochrome b . 19
1.3.3. Vùng kiểm soát (control region) . 20
1.3.4. Gen 16S rRNA 21
1.3.5. Intron vùng nhân . 22
1.3.6. Protein kinase C 22
1.3.7. Các nghiên cứu về quan hệ phát sinh loài phân tử của heo rừng 23
1.4. Bảo tồn heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên 24
1.4.1. Bảo tồn giao tử heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên . 25
1.4.2. Bảo tồn tế bào sinh dưỡng . 29
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1. Vật liệu . 32 iv

2.2. Phương pháp . 32
2.2.1. Điều tra các giống heo rừng đang được nuôi tại khu vực Tây Nguyên 32
2.2.2. Phân tích ADN, đánh giá hình thái. 33
2.2.3. Thu thập, nuôi thuần dưỡng heo rừng thuần Tây Nguyên thu nhận được 38
2.2.4. Bảo tồn nguồn gen heo rừng thuần Tây Nguyên 39
2.2.5. Phương pháp thống kê . 46
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN . 47
3.1. Điều tra các giống heo rừng đang được nuôi tại khu vực Tây Nguyên . 47
3.2. Phân tích ADN, đánh giá hình thái. . 47
3.2.1. Kết quả phân tích trình tự D-loop . 52
3.2.2. Kết quả phân tích trình tự cytochrome b . 57
3.2.3. Kết quả phân tích trình tự 16S 62
3.2.4. Đánh giá hình thái heo rừng thuần Tây nguyên 48
3.3. Thuần dưỡng heo rừng thuần Tây Nguyên Việt Nam thu nhận được . 65
3.3.1. Mô tả đặc điểm sinh học heo rừng thuần Tây Nguyên . 65
3.3.2. Thuần hóa heo rừng thuần Tây Nguyên 66
3.4. Bảo tồn nguồn gen heo rừng thuần Tây Nguyên- Việt Nam 70
3.4.1. Tinh trùng heo rừng 70
3.4.2. Đông lạnh tế bào . 76
KẾT LUẬN . 79
ĐỀ NGHỊ . 80
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 81
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 82
PHỤ LỤC v

DANH MỤC CÁC TỪ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT

ADN : Acid Deoxyribo Nucleic
bp : base pair
CPA : Cryoprotectant agents
ĐDSH : Đa dạng Sinh học
DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DMSO : Dimethyl Sulfoxide
EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
FBS : Fetal Bovine Serum
GEYC : Glycerol Egg Yolk Citrate
HST : Hệ sinh thái
IIF : Intracellular Ice Formation
NIH : National Institutes of Healthn
PBS : Phosphate-Buffered Saline
PCR : Polymerase Chain Reaction
ROS : Reactive Oxygen Species
SNP : Single Nucleotide Polymorphisms
TAE : Tris-Acetate-EDTA
TBT : Tế bào trứng
UV : Ultra Violet
YBP : Year Before Present vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Heo rừng trong điều kiện tự nhiên 4
Hình 1.2. Phân loại cây phát sinh loài theo Page và Holmes . 16
Hình 1.3. Cấu trúc ADN ty thể. 18
Hình 1.4. Cấu trúc của protein cytochrome b 20
Hình 1.5. Cấu trúc vùng kiểm soát của ty thể ở động vật có vú . 21
Hình 2.1. Các thông số đo bên ngoài của cơ thể heo rừng 33
Hình 2.2. Các chỉ số hộp sọ được phân tích. . 34
Hình 2.3. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích ADN ty thể 35
Hình 2.4. Sơ đồ tóm tắt quá trình thuần hóa. 38
Hình 2.5. Heo rừng thuần nguồn gốc Tây Nguyên. 39
Hình 2.6. Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm bảo tồn nguồn gen heo rừng . 40
Hình 2.7. Buồng đếm Neubauer 41
Hình 2.8. Các dạng kì hình của tinh trùng. . 43
Hình 2.9. Thu nhâ ̣n tinh từ mào tinh . 44
Hình 3.1. Các vị trí biến đổi trong vùng D-loop ty thể của các cá thể heo rừng. . 53
Hình 3.2. Cây phát sinh loài được thiết lập dựa trên trình tự D-loop 55
Hình 3.3. Các vị trí biến đổi trong vùng cytochrome b 58
Hình 3.4. Cây phát sinh loài được thiết lập dựa trên trình tự cytochrom b 61
Hình 3.5. Các vị trí biến đổi trong trình tự 16S. . 63
Hình 3.6. Cây phát sinh loài được thiết lập dựa trên trình tự 16S . 64
Hình 3.7. Heo rừng Sus scrofa khu vực Tây Nguyên. 66
Hình 3.8. Heo rừng được thuần hóa. . 67
Hình 3.9. Tinh trùng nhuộm Eosin-Nigrosin. . 72
Hình 3.10. Sự kết dính tinh trùng. . 73
Hình 3.11. Kỳ hình tinh trùng heo rừng thuần Tây Nguyên . 74
Hình 3.12. Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên nuôi cấy sơ cấp. 77
Hình 3.13. Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên nuôi cấy chuyền trong phòng thí
nghiệm. 77
Hình 3.14. Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên sau giải đông. 78
vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong PCR và giải trình tự . 36
Bảng 2.2.Thành phần phản ứng 36
Bảng 2.3. Chu kì phản ứng 37
Bảng 2.4. Nhiệt độ phản ứng của các đoạn mồi 37
Bảng 3.1. Nguồn gốc giống heo rừng đang nuôi trên đi ̣a bàn Tây Nguyên . 47
Bảng 3.2. Thông số đo cơ thể của heo. . 49
Bảng 3.3. Thông số đo hộp sọ của heo. 51
Bảng 3.4. Ma trận khoảng cách di truyền Tamura-Nei giữa các quần thể heo rừng
dựa trên trình tự D-loop. . 54
Bảng 3.5. Ma trận khoảng cách di truyền Tamura-Nei giữa các quần thể heo rừng
dựa trên trình tự cytochrome b. . 59
Bảng 3.6. Đi ̣a điểm và số lượng heo rừng thu nhâ ̣n trong tự nhiên 67
Bảng 3.7. Tỷ lê ̣ thuần hóa thành công . 68
Bảng 3.8. Một số đặc điểm sinh sản của heo rừng Tây Nguyên trong giai đoạn sinh
con . 69
Bảng 3.9. Một số đặc điểm sinh sản của heo rừng Tây Nguyên sau giai đoạn sinh
con . 70
Bảng 3.10. Các thông số của tinh dịch 71
Bảng 3.11. Tỉ lệ tinh trùng sống sau giải đông ở các nghiệm thức khác nhau . 75
Bảng 3.12. Tỷ lê ̣ sống của tinh trùng thu từ mào tinh đông la ̣nh . 76
1

PHẦN MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một trong những nơi được đánh giá có mức độ đa dạng sinh học
cao nhất trên thế giới. Hai loài heo rừng được xác định có tồn tại ở Việt Nam là Sus
bucculentus và Sus scrofa. Tuy nhiên, loài Sus bucculentus hiện nay khó tìm thấy
còn sống trong tự nhiên; loài Sus scrofa được cho là phân bố khá rộng, đặc biệt có
nhiều ở vùng rừng núi khu vực Tây Nguyên. Các nghiên cứu về đặc điểm hình thái
và di truyền của quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên cho đến nay còn rất
hạn chế.
Ở khu vực Tây Nguyên, các giống heo rừng mà người dân địa phương đang
nuôi hầu hết đều là heo lai được nhập từ các nước Thái Lan, Malaysia Các dòng
heo lai này có đặc điểm di truyền không rõ ràng, không có lý lịch và nguồn gốc cụ
thể. Việc phát triển chăn nuôi tự phát các giống heo rừng lai này sẽ làm tăng nguy
cơ đe dọa tới sự bảo tồn nguồn gen các quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây
Nguyên. Thêm vào đó, tình hình săn bắt bừa bãi, nạn chặt phá rừng đang là
nguyên nhân làm cho số lượng heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên bị giảm sút
nhanh và sẽ có nguy cơ đe dọa tới sự tồn vong của chúng. Do đó, các nghiên cứu về
việc thu nhận, thuần hóa và nhân rộng các quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây
Nguyên có vai trò rất quan trọng trong việc bảo tồn loài heo rừng của Việt Nam nói
chung và khu vực Tây Nguyên nói riêng.
Sự phân biệt những nhóm heo rừng khác nhau ngoài việc dựa vào đặc điểm
hình thái thì hiện nay người ta còn dựa vào kiểu gen, đặc biệt là các trình tự đặc
trưng trong các vùng bảo tồn của ADN nhân hoặc ADN ty thể. Các loài heo rừng
khác nhau có các vị trí đa hình nucleotide đơn (single nucleotide polymorphism) tạo
nên các haplotype đặc trưng cho loài heo đó. Trên cơ sở đó xây dựng cây phát sinh
loài để xác định được nguồn gốc và sự khác biệt giữa heo rừng có nguồn gốc Tây
Nguyên với các giống heo rừng khác.
Xuất phát từ những tình hình trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và di truyền của heo rừng Tây
Nguyên”. 2

2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
- Xây dựng được cây phát sinh loài và đánh giá một số đặc điểm sinh học heo rừng
Tây Nguyên.
- Góp phần bảo tồn nguồn gen heo rừng Tây Nguyên trong tự nhiên và trong phòng
thí nghiệm.
3. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài có ý nghĩa thực tiễn quan trọng trong việc xác định nguồn gốc di
truyền của heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên.
Các kết quả đạt được giúp định hướng bảo tồn nguồn gen quý hiếm của heo
rừng và từ đó có thể được ứng dụng trong sản xuất giống heo rừng thuần và heo
rừng lai từ nguồn gen heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên.
4. TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI
- Xác định được vị trí phân loại của heo rừng có nguồn gốc khu vực Tây Nguyên
trong mối quan hệ phát sinh loài của heo rừng trên thế giới.
- Xác định được 3 vị trí SNP mới của vùng D-loop và 3 vị trí SNP mới của gen
cytochrome b của heo rừng Tây Nguyên, giúp phân biệt giữa heo rừng Tây Nguyên
và các nhóm heo rừng khác.
- Đánh giá một số đặc điểm sinh học (sinh học sinh sản) của heo rừng khu vực Tây
Nguyên.
- Đánh giá đặc điểm sinh học của tinh heo rừng khu vực Tây Nguyên.