MỞ ĐẦU Hiện nay, do tình hình khủng hoảng năng lượng trên thế giới, vấn đề về ô nhiễm môi trường toàn cầu ngày một gia tăng nên các nước đều có xu hướng đi tìm những nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ sạch hơn, an toàn và bền vững hơn, một trong số đó là nhiên liệu sinh học (NLSH). Đây là dạng nhiên liệu có thể tái tạo được và để thay thế dần nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng bị cạn kiệt. Nhiều quốc gia trong vòng 2 - 3 thập kỷ qua đã tập trung nghiên cứu sử dụng NLSH (xăng/diesel pha ethanol và diesel sinh học), thay thế một phần xăng, dầu khoáng, tiến tới xây dựng ngành “xăng dầu sạch” ở quốc gia mình. Hiện có khoảng 50 nước trên thế giới khai thác và sử dụng NLSH ở các mức độ khác nhau. Nhìn chung, các nước trên thế giới đi theo hai hướng phát triển NLSH: ethanol nhiên liệu, được sản xuất chủ yếu từ ngô (Mỹ), mía đường (Brazil), sắn (Thái Lan), . còn diesel sinh học (hay còn gọi là biodiesel) sản xuất từ cải dầu, hướng dương (châu Âu), cọ dầu (Đông Nam Á), dầu mỡ phế thải, JCL, tảo, . (Đặng Tùng, 2007). Diesel sinh học nguồn gốc động thực vật được sản xuất năm 2005 đạt 4 triệu tấn và dự kiến đến năm 2010 sẽ tăng lên đến 20 triệu tấn. Tại châu Âu , nhiều công ty đã nghiên cứu sản xuất diesel sinh học từ dầu đậu nành, dầu hạt cải, dầu hướng dương. Các nước như Anh, Pháp, Đức, Tây Ban Nha, Áo, Đan Mạch đã đầu tư rất nhiều vào các chương trình NLSH. Cây Cọc rào – Jatropha curcas L. (JCL) hay còn được gọi là cây Dầu mè, Dầu lai, (tên tiếng Anh: Physic nut) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Cây có nguồn gốc châu Mỹ và được người dân nơi đây sử dụng như một loại dược liệu. Cây dạng bụi, lưu niên, có thể cao tới 5m. Đây là loài cây đa mục đích, tất cả các phần của cây đều có giá trị sử dụng. Tuy nhiên, sản phẩm quan trọng nhất vẫn là hạt lấy dầu cho sản xuất diesel sinh học. Cây JCL đã du nhập vào Việt Nam từ rất lâu, được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, trồng làm hàng rào và hạt được sử dụng để thắp sáng. JCL có những ưu điểm về điều kiện gây trồng, năng suất, hàm lượng dầu, về lợi ích môi trường và kinh tế và gắn chặt với đời sống và thu nhập cộng đồng nông thôn. Chính vì thế cây JCL đã được chọn là một trong các cây trồng để sản xuất dầu diesel sinh học – biodiesel (Saxena, 2007). JCL được biết đã có mặt tại Việt Nam, tuy nhiên năng suất hạt và hàm lượng dầu chưa được khảo sát đánh giá. Hơn nữa, cho đến nay đã có rất nhiều giống cây JCL đã được chọn tạo và đưa vào thương mại hóa tại nhiều quốc gia như Ấn Độ, Brazil, Malaysia, Thái Lan, Việc nghiên cứu khảo nghiệm tính thích ứng của giống, so sánh đánh giá để tìm ra những giống phù hợp với điều kiện của nước ta là công việc trước tiên, kế đó là tìm biện pháp nhân nhanh giống cây JCL. Đối với cây JCL có thể nhân giống bằng hạt, bằng giâm hom. Tuy nhiên, những biện pháp trên có nhược điểm là việc sử dụng hạt để nhân giống sẽ cho chất lượng giống không đồng đều, do cây JCL có khả năng giao phấn, hạt không duy trì được đặc tính di truyền tốt vốn có của nó mà phôi của hạt nhiều khi bị biến dị, cho ra những cây kém chất lượng. Chính vì vậy, để có số lượng lớn cây giống với chất lượng cây tốt, đồng nhất về mặt di truyền đáp ứng được yêu cầu mở rộng nhanh diện tích trồng cây JCL thì tốt nhất là sử dụng biện pháp nhân nhanh in vitro kết hợp với ex vitro. Mục tiêu đề tài: Luận văn này tập trung nghiên cứu một số biến đổi trong quá trình phát sinh hình thái từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây JCL in vitro và xác định khả năng tạo các cơ quan chồi, rễ từ lớp mỏng tế bào lá nhằm xây dựng một quy trình tái sinh cây từ lá của cây, phục vụ công tác nhân giống in vitro và nghiên cứu chuyển gen tạo giống mới. Nội dung nghiên cứu: Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện khử trùng, bao gồm nồng độ của hóa chất được dùng để khử trùng là natri hypoclorid – NaOCl (Javel) và thời gian khử trùng lên các chồi ngọn (shoot tip) và chồi nách (axillary shoot) của cây JCL khi đưa vào nuôi cấy in vitro tạo nguồn vật liệu ban đầu cho các thí nghiệm về sau. Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của một số chất ĐHSTTV riêng lẻ và tổ hợp giữa chúng lên khả năng tạo mô sẹo và phát sinh các cơ quan chồi, rễ của mô cấy lớp mỏng tế bào lá cây JCL in vitro. Nội dung 3: Khảo sát một vài biến đổi về phát sinh hình thái và sinh lý ở một số mẫu cấy lớp mỏng tế bào lá JCL in vitro tại một số thời điểm trong quá trình nuôi cấy. MỤC LỤC Trang Mục lục i Danh mục các chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi Danh mục ảnh . vii MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Sơ lược về các đặc điểm của cây Cọc rào . 4 1.1.1. Phân loại khoa học 4 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố 4 1.1.3. Đặc điểm hình thái – Đặc tính sinh học 5 1.1.4. Các ưu điểm sinh học và giá trị của cây Cọc rào 7 1.2. Tình hình nghiên cứu, sử dụng, phát triển NLSH và biodiesel từ cây Cọc rào trên thế giới và Việt Nam 9 1.2.1. Thế giới . 9 1.2.2. Việt Nam . 12 1.3. Sự phát sinh hình thái thực vật 14 1.3.1. Định nghĩa . 14 1.3.2. Sự phát sinh cơ quan chồi và rễ 14 1.3.2.1. Sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi . 14 1.3.2.2. Sự phát sinh cơ quan rễ 15 1.3.3. Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sự phát sinh hình thái . 16 1.3.3.1. Auxin 17 1.3.3.2. Cytokinin 18 1.3.3.3. Giberelin . 19 1.3.3.4. Acid abcisic 19 1.3.3.5. Ethylene 19 1.3.4. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái thực vật 20 1.3.4.1. Tuổi và kích thước mô cấy . 20 1.3.4.2. Ánh sáng . 20 1.3.4.3. Nguồn đạm trong môi trường nuôi cấy 20 1.3.4.4. Sự cấy chuyền . 20 1.4. Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong nghiên cứu tái sinh, nhân giống thực vật . 21 1.4.1. Khái niệm lớp mỏng tế bào . 21 1.4.2. Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào . 21 1.4.3. Những đặc điểm của hệ thống lớp mỏng tế bào . 22 1.4.4. Nhân giống in vitro và phát sinh hình thái cây thân gỗ bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào 24 1.5. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro cây Cọc rào . 25 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 2.1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và vật liệu nghiên cứu . 28 2.1.1. Thiết bị . 28 2.1.2. Dụng cụ 29 2.1.3. Hóa chất . 29 2.1.4. Vật liệu 30 2.2. Phương pháp 31 2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của Javel và thời gian khử trùng lên các chồi ngọn và chồi bên cây JCL khi đưa vào nuôi cấy in vitro . 31 2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của một số chất ĐHSTTV lên khả năng tạo mô sẹo và tái sinh các cơ quan chồi, rễ của mẫu cấy từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào mảnh lá JCL in vitro . 34 2.2.2.1. Nghiên cứu sự hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL 37 2.2.2.2. Nghiên cứu sự tạo chồi từ mô sẹo tế bào lá cây JCL . 38 2.2.2.3. Nghiên cứu sự tạo rễ từ mô sẹo tế bào lá cây JCL . 38 2.2.2.4. Khảo sát họat tính một số chất ĐHSTTV ở các mẫu cấy trong quá trình tạo mô sẹo và tái sinh 39 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 43 3.1. Kết quả 43 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của Javel và thời gian khử trùng lên các chồi ngọn và chồi bên cây JCL khi đưa vào nuôi cấy in vitro . 43 3.1.2. Sự hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL 45 3.1.2.1. Ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá JCL 45 3.1.2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp auxin và cytokinin lên sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá JCL 46 3.1.3. Sự tạo chồi từ mô sẹo tế bào lá cây JCL 56 3.1.4. Sự tạo rễ từ mô sẹo tế bào lá cây JCL 63 3.1.5. Khảo sát họat tính các chất ĐHSTTV trong mẫu cấy ở các thí nghiệm nghiên cứu sự phát sinh hình thái từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây JCL . 67 3.2. Thảo luận 70 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 77 4.1. Kết luận 77 4.2. Đề nghị 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC a
