Luận Văn Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume)


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH . v
KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 3
1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 3
1.1.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) 3
1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào . 3
1.1.2.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào . 4
1.1.2.3. Sự trẻ hoá 4
1.1.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV 5
1.1.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV . 6
1.1.5. Các phương pháp nuôi cấy mô TBTV 6
1.1.5.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng . 7
1.1.5.2. Nuôi cấy mô sẹo. . 7
1.1.5.3. Nuôi cấy bao phấn và túi phấn. 8
1.1.5.4. Nuôi cấy protoplast . 9
1.1.5.5. Nuôi cấy mô cơ quan tách rời . 9
1.1.5.6. Nuôi cấy tế bào đơn 10
1.1.6. Môi trường nuôi cấy mô TBTV 10
1.1.6.1. Khoáng đa lượng 11
1.1.6.2. Khoáng vi lượng 12
1.1.6.3. Nguồn cacbon . 12
1.1.6.4. Các vitamin . 13
1.1.6.5. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác . 13
ii
1.1.6.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 14
1.1.7. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật 18
1.1.7.1. Giai đoạn chuẩn bị . 18
1.1.7.2. Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy 18
1.1.7.3. Giai đoạn nhân nhanh . 19
1.1.7.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh . 19
1.1.7.5. Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm 20
1.1.8. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nhân giống nuôi cấy mô TBTV 20
1.1.8.1. Điều kiện vô trùng . 20
1.1.8.2. Ánh sáng và nhiệt độ . 22
1.1.8.3. pH môi trường . 23
1.2. Giới thiệu về cây lan gấm 23
1.2.1. Phân loại thực vật 23
1.2.2. Đăc điểm thực vật . 24
1.2.3. Sự phân bố 26
1.2.4. Tính dược liệu và công dụng 26
1.2.5. Tình hình nghiên cứu cây lan gấm 27
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 28
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 28
2.1.3. Điều kiện nuôi cấy 28
2.2. Nội dung nghiên cứu. . 29
2.3. Địa điểm thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu. . 30
2.4. Phương pháp nghiên cứu. . 30
2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm. . 30
2.4.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu kỹ thuật vô mẫu cây lan Gấm 30
2.4.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi. . 32
2.4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả
năng nhân nhanh chồi 33
iii
2.4.1.4. Thí nghiệm 4 : Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
đến khả năng nhân nhanh chồi 33
2.4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng nhân nhanh . 35
2.5. Phương pháp xử lý số liệu. . 36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 37
3.1. Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu lan gấm . 37
3.1.1. Khử trùng bằng Javen 37
3.1.2. Khử trùng bằng chlorine 39
3.1.3. Khử trùng kết hợp Javen và Chlorin . 40
3.2. Tái sinh chồi 42
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường khoáng thích hợp để nhân nhanh
chồi lan gấm 45
3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng
nhân nhanh thể chồi 46
3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi.
. 47
3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh
chồi. . 49
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi 50
3.5. Khảo sát quá trình nhân nhanh 53
3.6. Đề xuất quy trình nhân nhanh lan gấm . 55
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
4.1. Kết luận . 57
4.2. Kiến nghị . 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
PHỤ LỤC
iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Công thức khử trùng mẫu . 31
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng nhân nhanh chồi của
vật liệu nuôi cấy 33
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi. 34
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của các nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi. . 34
Bảng 2.5. Ảnh hưởng của các nồng độ TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi. . 35
Bảng 2.6: Khảo sát quá trình nhân nhanh 36
Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Javen 37
Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Chlorine . 39
Bảng 3.3. Hiệu quả khử trùng với sự kết hợp Javen và Chlorine. 40
Bảng 3.4. So sánh hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. . 41
Bảng 3.5. Khả năng tái sinh chồi mẫu cấy . 42
Bảng 3.6. Ảnh hưởng môi trường khoáng thích hợp nhân nhanh lan gấm. . 45
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi . 47
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi 49
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi sau 6tuần nuôi cấy51
Bảng 3.10. Khảo sát quá trình nhân nhanh . 53
v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cây lan gấm Anoectochilus setaceus Blume 25
Hình 3.1. Biểu đồ hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. 41
Hình 3.2. Mẫu sau khi khử trùng 42
Hình 3.3. Sự tái sinh chồi . 44
Hình 3.4. Sự phát triển hình thái chồi trên các môi trường khoáng 46
Hình 3.5. Sự phát triển hình thái chồi với các nồng độ BA khác nhau 48
Hình 3.6. Sự phát triển của chồi với các nồng độ Kinetin khác nhau . 50
Hình 3.7. Sự phát triển của chồi với các nồng độ TDZ khác nhau 52
Hình 3.8. Khảo sát quá trình nhân nhanh 54
Hình 3.9. Khảo sát quá trình nhân nhanh protocorm 55
Hình 3.10. Quy trình nhân nhanh lan gấm . 56
vi
KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
TBTV : Tế bào thực vật
DNA : Deoxyribonucleotic acid
RNA : Ribonucleotic acid
MS :Murashige&Skoog
VW :Vaccine và Went
KC :Kundson C
LS : Linsmainer và Skoog
ATP : Adenosine triphosphate
GA3 : Acid ascorbic
ĐTD : Đơn tử diệp
STD : Sông tử diệp
1
LỜI MỞ ĐẦU
Thế kỉ 21 được coi là thế kỷ của sự phát triển công nghệ sinh học trong đó
dược liệu là tài nguyên di truyền - tài nguyên tái tạo. Nắm được, phát huy được tài
nguyên di truyền là nắm kinh tế, nắm tương lai. Dùng thế mạnh dược liệu đẩy
--tộc.Từ lâu, người phương đông đã tôn hoa Lan là “ vương giả chi hoa” và người
phương tây cũng tôn hoa Lan là “ nữ hoàng của các loài hoa”. Hoa Lan đã chinh
phục người phương Đông và người phươngTây không chỉ cấu trúc kì diệu và sự đa
dạng về màu sắc, hình dáng và hương thơm quyến rũ mà còn bỡi giá trị làm thuốc
của nó.
Từ xưa, người ta đã tiến hành nhân giống các loài Lan bằng nhiều phương
pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn
nhiều nhược điểm như mất thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân
thấp, dễ bị thoái hoá qua nhiều thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lượng
cây không đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ. , Hơn nữa, hạt lan lại quá
nhỏ, chỉ có một phôi; nảy mầm cần sự có mặt của nấm cộng sinh nên tỷ lệ nảy mầm
trong tự nhiên là rất thấp. Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay người ta tiến
hành nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực, cây con được tạo ra
với số lượng lớn đồng nhất về kiểu hình, chất lượng đảm bảo, sạch bệnh, giá thành
phù hợp và không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết. Nhờ đó đáp ứng nhu cầu không
ngừng tăng lên của thị trường Đây là điều mà phương pháp truyền thống không
thực hiện được.
Nói đến chi lan gấm Anoectochilus, thì loài lan gấm Anoectochilus setaceus
Blume được biết đến nhiều hơn cả không chỉ bởi giá trị làm cảnh do lá và hoa đẹp
mà còn vì giá trị làm thuốc của nó. Theo các tài liệu y học thế giới, lan gấm là loài
cây thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, phòng bệnh, có tính kháng
khuẩn, làm khí huyết lưu thông, chữa các bệnh viêm khí quản, lao phổi, chống tăng
2
huyết áp, đau nhức khớp xương Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả
năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này.
Như vậy, lan Gấm Anoectochilus setaceus. Blume là loại thảo dược có giá trị
và có tiềm năng rất lớn.Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam số lượng loài này trong tự
nhiên được phát hiện còn rất ít mà lại bị thu hái cả cây với số lượng lớn để bán làm
thuốc (500,000VNĐ/ kg tươi) do vậy loài lan này đang bị đe doạ mạnh và đứng
trước nguy cơ tuyệt chủng nếu không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan
Gấm được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP; và nhóm thực vật đang
nguy cấp EN A1a, c, d trong Sách Đỏ Việt Nam 2007.
Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự cho phép của Bộ môn Công nghệ
sinh học- Viện công nghệ sinh học và môi trường - trường Đại học Nha Trang, tôi
tiến hành đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Gấm (Anoectochilus
setaceus Blume) ” tìm ra điều kiện thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm bằng kỹ
thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.
3
Chương I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ được dùng một cách rộng rãi để nói
về việc mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ
quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng [3]
Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện
như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh trưởng thực
vật để điều khiển qúa trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo
mục tiêu và yêu cầu đặt ra.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả
nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật. Phương pháp này giúp mở
ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh
tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở tế bào thực vật và
nhiều vấn đề sinh học khác
Tất cả dạng nuôi cấy mô đều được tiến hành qua hai bước:
- Các phần của thực vật hoặc một cơ quan thực vật nào đó được tách ra khỏi
phần còn lại. Đó là sự tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác lẫn nhau
trong một tổ chức thực vật nguyên vẹn.
- Các phần tách ra nói trên phải đặt trong môi trường thích hợp để nó có thể biểu
lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó.[3]
1.1.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV)
1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào
Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả
năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi .
Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng
đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn năng
của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời". Theo ông: “Tế bào
4
bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền
(DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, m ỗi tế bào
đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”.
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, các nhà khoa học đã chứng
minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng
rẽ.[7]
1.1.2.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào
Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể
hiện một chức năng nào đó.
Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ
tế bào phôi. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này
quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình
đó gọi là quá trình phản biệt hóa.
Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt
hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào càng
chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy ra quá trình
phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật, tế bào.
Người ta đã tổng kết rằng; những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao
nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu.
Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các
tế bào của cơ quan sinh sản (hạt phấn, noãn) rất dễ xảy ra quá trình phản biệt hóa.
Vì vậy nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả
năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều
hướng từ ngọn xuống gốc.
1.1.2.3. Sự trẻ hoá
Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần cơ quan thực vật là rất khác nhau. Vì
vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu.
Trong nuôi cấy mô TBTV( hay còn gọi là nuôi cấy in vitro), các mẫu non trẻ có sự