Luận Văn Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải coker312 và Việt Nam36P bằng vi khuẩn Agro

TÓM TẮT


Bông vải là một trong những cây trồng quan trọng ở nước ta. Với sự phát triển của công nghệ sinh học, các gen mong muốn có thể chuyển vào cây bông vải nhằm nâng cao năng suất, chất lượng xơ cũng như khả năng kháng sâu bệnh bằng các phương pháp khác nhau trong đó phương pháp chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được sử dụng phổ biến nhất. Trong qui trình chuyển nạp gen vào cây trồng, hệ thống chọn lọc thông thuờng nhất là dùng các chất kháng sinh làm tác nhân chọn lọc. Việc chuyển nạp gen đánh dấu chọn lọc kháng chất kháng sinh vào cây trồng để sử dụng chất kháng sinh làm tác nhân chọn lọc đã gây nên những lo ngại về tính an toàn sinh học của cây biến đổi gen. Gần đây để khắc phục nhược điểm này, hệ thống chọn lọc mới bằng mannose đã được nghiên cứu để thay thế hệ thống chọn lọc dùng các chất kháng sinh.

Mục đích khóa luận này nhằm nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, trong đó chủ yếu nghiên cứu hiệu quả của hệ thống chọn lọc bằng mannose, vì đây là hệ thống chọn lọc mới ở cây bông vải.

Trong khoá luận này, vắc tơ (vector) pManCa đã được thiết kế mang gen đánh dấu chọn lọc pmi (để sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose) và gen gus. Mô khởi đầu dùng để nuôi cấy là các khúc cắt trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 – 7 ngày tuổi. Thanh lọc mannose được thực hiện qua 3 vòng.

Kết quả thu được như sau:

Qua 2 vòng chọn lọc trên môi trường mannose, số mẫu mô sẹo sống sót vẫn đạt tỷ lệ cao ở cả mẫu đốI chứng không chuyển nạp gen. Đến vòng chọn lọc thứ 3, khi số mẫu mô sẹo được tách nhỏ, kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sót ở giống Coker 312 là 10,4% và ở giống VN36P là 13,6%, so với mẫu đối chứng (không chuyển nạp gen) có 0% tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sót. Điều này cho thấy hệ thống chọn lọc mannose có hiệu quả trong thanh lọc chuyển nạp gen.

Kết quả cho thấy giống bông Việt Nam VN36P cho hiệu quả cao trong nuôi cấy mô như giống bông đối chứng quốc tế Coker 312. Giống bông VN36P có thể được lưu ý trong chương trình tạo giống bông Việt Nam biến đổi gen.

Để hoàn thiện qui trình chọn lọc mannose đối với bông vải cần tiếp tục nghiên cứu thêm về các mức liều lượng đường mannose và glucose ở mỗi vòng thanh lọc và thời gian chọn lọc để nâng cao hiệu quả chọn lọc, giảm thiểu điều kiện cho hiện tượng thoát mẫu.


ABSTRACT


Supervisor: Dr. Tran Thi Cuc Hoa




Cotton is an important crop in Vietnam. With the development of biotechnology, genes of interest can be engineered into the cotton plant to increase yield, fiber quality and the ability to resist insect pests as well, using different methods of transformation, of which Agrobacterium tumefaciens-mediated method is most popular. In the procedure of plant transformation, the most common selection system was the use of antibiotics as selective agents. The transfer of gene for antibiotic resistance into plants to allow the use of antibiotics as selective agents has cause concerns on biosafety of transgenic plants. Recently to overcome this shortcoming, a new selection system using mannose was studied to replace the selection system using antibiotics.

The objectives of this assignment were to study the ability of gene transformation of two cotton cultivars, Coker 312 and VN36P by using Agrobacterium tumefaciens, in which the focus was to study the use of mannose selection because this selection system is new for gene transformation of cotton.

In this study, the vector, pManCa harboring the selective marker gene, pmi (to allow the use of mannose for selection) and the gene gus was used for transformation. The explants were hypocotyl segments isolated from 5-7 day old seedlings in vitro. Three selection cycles with mannose were done.

The results obtained from this study are summarized as follows.

After 2 cycles of selection with mannose, the survival percentage of callus samples in the selective medium were still high, both in the check (non-transformed) and transformed samples. At the third cycle of selection, when the calli were separated into smaller pieces, the results of selection showed that the survival percentage of sample were 10.4% for Coker and 13.6% for VN36P as compared to the non-transformed samples which showed 0% of survival. This indicated that mannose selection system was efficient in cotton transformation.

The results showed that the Vietnamese cotton VN36P gave high efficiency in tissue culture as the international variety, Coker 312. The variety, VN36P should be given an attention in the breeding program of Vietnamese transgenic cotton varieties.

To perfect the procedures of mannose selection system, studies should be done further to investigate the mannose concentrations in each cycle of section, duration of section to increase the selection efficiency and minimize the escape cases during selection process.



MỤC LỤC


CHƯƠNG TRANG

Trang tựa

Lời cảm tạ iii

Tóm Tắt iv

Abstract v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các hình ix

Danh sách các bảng x


1.MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Mục tiêu của khóa luận 3

1.3. Hạn chế của khóa luận 3

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1. Sơ lược về Cây bông vải 4

2.1.1. Vị trí và phân loại 4

2.1.2. Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố 4

2.1.2.1. Loài Gossypium arboreum 4

2.1.2.2. Loài Gossypium hirsutum 4

2.1.2.3. Loài Gossypium barbadense 5

2.1.2.4. Loài Gossypium herbaceum 5

2.1.2.5. Loài Gossypium tricuspidatum 5

2.1.3. Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam 5

2.1.4. Tình hình sản xuất bông trên Thế Giới 7

2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải 9

2.3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 11

2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 11

2.3.2. Ti-plamid 12

2.3.2.1. Chức năng của T-DNA 12

2.3.2.2. Chức năng của gen Vir 14

2.3.2.3. Cơ chế lây nhiễm 16

3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1. Nội dung nghiên cứu 18

3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện 18

3.3. Vật liệu nghiên cứu 18

3.4. Phương pháp nghiên cứu 18

3.4.1 Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy 18

3.4.2 Quy trình chuyển nạp gen 20

3.4.2.1. Nguồn Plasmid 20

3.4.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn 20

3.4.2.3. Lây nhiễm 20

3.4.2.4. Thanh lọc 21

3.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi 22

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1. Sự hình thành và phát triển của mô sẹo 23

4.2. Tỷ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau các lần thanh lọc 27

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

5.1. Kết luận 33

5.2. Đề nghị 33

6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

7. PHỤ LỤC 39



“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI COKER 312 VÀ VN36P BẰNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ”.