Luận Văn Nghiên cứu khả năng chống Oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại và enzyme b

Khóa luận tốt nghiệp năm 2011
Đề tài: Nghiên cứu khả năng chống Oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại và enzyme bổ sung


MỤC LỤC
Trang
Lời cám ơn . i
Mục lục ii
Danh mục chữ viết tắt . v
Danh mục bảng vi
Danh mục hình . vii
Lời mở đầu 1
Chương I. Tổng quan . 3
1.1. Protein thủy phân 3
1.1.1. Giới thiệu 3
1.1.2. Thành phần hóa học 4
1.1.3. Đặc điểm, tính chất . 5
1.1.4. Phương pháp sản xuất protein thủy phân . 5
1.1.5. Giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học Artemia . 6
1.2. Artemia 7
1.2.1. Giới thiệu 7
1.2.2. Tình hình nuôi Artemia ở Việt Nam . 9
1.2.3. Thành phần hóa học và sử dụng Artemia ở ViệtNam . 10
1.3. Gốc tự do và khả năng chống oxy hóa . 11
1.3.1. Gốc tự do và oxy hóa 11
1.3.2. Chất chống oxy hóa 13
Chương II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu . 15
2.1. Nguyên vật liệu 15
2.1.1. Artemia . 15
2.1.2. Enzyme . 17
iii
2.1.3. Hóa chất . 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu 18
2.2.1. Bố trí thí nghiệm 18
+ Thí nghiệm 1: Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy
phân A. franciscana bằng enzyme nội tại . 18
+ Thí nghiệm 2: Lựa chọn loại enzyme thích hợp cho quá trình thủy
phân protein Artemia . 20
+ Thí nghiệm 3: Xác định tỷ lệ enzyme protease bổ sung so với
nguyên liệu . 22
+ Thí nghiệm 4: Xác định thời gian thủy phân thích hợp cho quá
trình thủy phân protein A. franciscana. . 24
+ Thí nghiệm 5: Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp cho quá
trình thủy phân protein A. franciscana. . 26
2.2.2. Phương pháp phân tích 28
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu . 28
Chương III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 29
3.1. Thành phần hóa học của nguyên liệu A. franiciscana . 29
3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân protein A. franciscana bằng
enzyme nội tại . 30
3.3. Ảnh hưởng của các loại enyme protease đến khả năng chống oxy hóa của
dịch thủy phân protein của A. franciacana . 33
3.4. Tỷ lệ enzyme protease bổ sung so với nguyên liệu thích hợp cho quá trình
thủy phân protein A. franciscana . 34
3.5. Thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân proteinA. franciscana 36
3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chống oxy hóa của dịch thủy
phân protein A. francicana 38
iv
Chương IV.Kết luận và đề xuất 40
4.1. Kết luận 40
4.2. Đề xuất ý kiến 40
Tài liệu tham khảo 41
Phụ lục
v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ĐC: Đối chứng.
DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl.
HUFA: Acid béo chưa bão hòa bậc cao (Highly Unsaturated Fatty Acids)
(có mạch từ 20 carbon trở lên và có từ 4 – 6 nối đôi).
MUFA: Acid béo bão hòa một nối đôi ( Mono Unsaturated Fatty Acids).
PUFA: Các acid béo chưa bõa hòa có nhiều nối đôi (Poly Unsaturated Fatty
Acids) có từ 2 nối đôi trở lên.
SFA: Các acid béo bão hòa (Saturated Fatty Acids).
TFA: tổng số acid béo (Total Fatty Acids).
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Nhiệt độ và pH tối thích của các chế phẩmprotease thương mại 17
Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của A. franciscananguyên liệu (% so
với nguyên liệu ướt) 29
Bảng 3.2. Thành phần acid amin của mẫu A. franciscana nguyên liệu . 29
Bảng 3.3. Thành phần acid béo của A. franciscananguyên liệu 30
vii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Phản ứng thủy phân protein 3
Hình 1.2. Phản ứng thủy phân protein xúc tác bởi enzyme 3
Hình 1.3. Sơ đồ vòng đời của Artemia . 8
Hình 2.1. Hình ảnh Artemia franciscana 15
Hình 2.2. Quy trình thu và xử lý mẫu . 16
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm
thủy phân protein A. franciscanabằng enzyme nội tại theo thời gian . 19
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn loại enzyme thích hợp cho quá trình
thủy phân protein A. franciscana 21
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ enzyme thích hợp cho quá trình
thủy phân proteinA. franciscana 23
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian thích hợp cho quá trình thủy
phân protein A. franciscana 25
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy
phân protein A. franciscana 27
Hình 3.1. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch thủyphân protein A.
franciscana bằng enzyme nội tại 31
Hình 3.2. Tổng năng lực khử của dịch thủy phân protein A. franciscana bằng
enzyme nội tại . 31
Hình 3.3. Ảnh hưởng của các loại enzyme khác nhau đến khả năng khử gốc
tự do DPPH của dịch thủy phân proteinA. franciscana . 33
Hình 3.4. Tổng năng lực khử của dịch thủy phân protein A. franciscana bằng
các loại enzyme protease bổ sung khác nhau 33
Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Protamex đến khả năng khử gốc tự do
DPPH của dịch thủy phân proteinA. franciscana 35
viii
Hình 3.6. Tổng năng lực khử của dịch thủy phân protein A. franciscana bằng
enzyme protease bổ sung với tỷ lệ khác nhau . 35
Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khảnăng khử gốc tự do
DPPH của dịch thủy phân protein A. franciscana . 37
Hình 3.8. Tổng năng lực khử của dịch thủy phân A. franciscanavới enzyme
bổ sung trong khoảng thời gian khác nhau . 37
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng khử gốc tự do DPPH của
dịch thủy phân proteinA. franciscana 38
Hình 3.10. Tổng năng lực khử của dịch thủy phân protein A. franciscana
trong các khoảng thời gian thủy phân khác nhau 39
1
LỜI MỞ ĐẦU
Cơ thể con người và động vật thường xuyên đòi hỏi cung cấp chất dinh
dưỡng có trong thức ăn để có thể tiến hành trao đổichất duy trì sự sống, tăng
cường sinh trưởng và phát triển. Protein là nguồn cung cấp nitơ cho cơ thể
người và động vật. Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc
đa phân mà các đơn phân là acid amin, chúng kết hợpvới nhau thành một
mạch dài nhờ các liên kết peptid. Phản ứng liên quan đến việc phá vỡ các
nhóm amino acid thành các mạch, nhánh nhỏ hơn sử dụng nước được gọi là
sự thủy phân protein. Sự thủy phân protein diễn ra rất chậm chạp khi ở điều
kiện thường, nhưng khi có mặt của enzyme sẽ thúc đẩy phản ứng thủy phân,
cắt mạch thành nhiều phân tử nhỏ hơn (amino acid làchính). Tùy theo mức
độ và thời gian thủy phân mà thành phần trong dịch thủy phân sẽ có sự khác
nhau. Dịch thủy phân protein có chứa các thành phầnpeptid, đây là nguồn
cung cấp dinh dưỡng cho người. Thông thường các peptid là những tác nhân
điều hòa hoạt tính của các phân tử khác. Sự điều hòa này thông qua mối
tương tác của peptid với các phân tử chịu sự điều hòa. Như vậy có các peptid
với hoạt tính hoocmon, các peptid khác với hoạt tính kháng khuẩn một số
peptid được cơ thể tổng hợp trực tiếp, một số là sản phẩm của quá trình thủy
phân của các phân tử protein. Vì vậy peptid của quátrình thủy phân có hoạt
tính sinh học cao cụ thể hơn là dịch thủy phân protein có hoạt tính chống oxy
hóa cao.
Artemia là tên của một loài giáp xác nhỏ sống ở những vùng nước mặn
có biên độ mặn rộng từ vài phần nghìn đến 250‰. Trong tự nhiên người ta
thường gặp Artemia sống ở các hồ nước mặn. Từ nhữngnăm 30 của thế kỷ
trước, người ta biết đến Artemia là do phát hiện thấy Artemia chính là loại
động vật giàu protein nên rất thích hợp cho việc dùng làm thức ăn để ươm
nuôi các loài động vật thủy sản như tôm, cá, động vật thân mềm
2
Hiện nay việc nghiên cứu chế biến Artemia còn rất hạn chế, dạng chủ
yếu sử dụng Artemia là làm thức ăn cho ấu trùng cá,tôm, cua, vì trong thành
phần của Artemia có chứa hàm lượng protein, các acid béo cao. Thực trạng
khai thác sử dụng protein từ Artemia còn hạn chế nên cần được mở rộng
nghiên cứu theo hướng khác, đặc biệt là hướng nghiên cứu ứng dụng dịch
thủy phân protein từ Artemia nhằm khai thác có hiệuquả nguồn protein giá trị
này. Được sự phân công của Ban chủ nhiệm Khoa Chế biến em đã thực hiện
đề tài ” Nghiên cứu khả năng chống Oxy hóa của dịch protein Artemia thủy
phân bằng enzyme nội tại và enzyme bổ sung” để hiểu rõ hơn về hoạt tính
chống oxy hóa của dịch protein thủy phân và có hướng sử dụng hiệu quả
hơn protein có trong nguyên liệu Artemia. Đề tài thành công sẽ góp phần
làm cơ sở cho việc sử dụng dịch thủy phân protein từ Artemia phục vụ
cho lợi ích chống oxy hóa thường gặp ở người, nâng cao khả năng sử
dụng Artemia trong đời sống con người.
3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1 . Protein thủy phân
1.1.1. Giới thiệu
Qúa trình thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị dương
trong hợp chất hữu cơ thành các đơn phân dưới tác dụng của chất xúc tác có
sự tham gia của nước trong phản ứng.
H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH- H2N-CH-COOH+ H2
N-CH-NH-
Hình 1.1. Phản ứng thủy phân protein
Enzyme protease xúc tác dụng và chuyển hóa cơ chất qua 3 giai đoạn
- Giai đoạn 1: enzyme kết hợp cơ chất tạo phức hợp enzyme- cơ chất ES
không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp.
- Giai đoạn 2: tạo phức chất hoạt hóa, là giai đoạnxảy ra sự biến đổi cơ chất
dưới tác dụng của 1 số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme và
làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động. Một số liên kết
trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi.
- Giai đoạn 3: là giai đoạn tạo thành sản phẩm và giải phóng enzyme. Đây là
giai đoạn cuối của quá trình phản ứng. Từ cơ chất sẽ hình thành sản phẩm và
enzyme được giải phóng dưới dạng tự do như ban đầu.
Hình 1.2. Phản ứng thủy phân protein xúc tác bởi enzyme
R1
R2
H2
O
Protease R1 R2
Acid amin peptid
H2O
ES
E+ S EP + H-P
+
E+ P- OH+ H-P
+
4
Enzyme có bản chất là protein, có khả năng tương tác lên liên kết nhị
dương và làm thay đổi các liên kết thủy phân trong phân tử cơ chất, làm cho
các liên kết này bị suy yếu và dễ dàng bị đứt ra khi có yếu tố nước tham gia.
Cơ chế tác dụng của enzyme lên cơ chất thủy phân: giai đoạn đầu có
sự hình thành phức hợp trung gian ES, sự tạo thành này có thể theo 2 kiểu
sau:
- Kiểu thứ nhất: là kiểu hình thành đơn giản, tâm ái nhân của ái nhân(-)
của gen tương tác nhanh với 1 trong 2 ngyên tử tíchđiện dương của liên kết
nhị dương. Sau khi tương tác sẽ làm thay đổi mật độelectron và làm suy yếu
liên kết nhị dương tạo điều kiện cắt đứt liên kết. Các nhà nghiên cứu kiểu cơ
chế này xảy ra khi tâm ái của enzyme mạnh và sự khuyết điện tử của liên kết
nhị dương lớn.
- Kiểu thứ 2: lúc đầu các nguyên tử khuyết điện tử trong liên kết trong
liên kết nhị dương chưa thể đính trực tiếp vào tâm ái nhân của trung tâm hoạt
động của enzyme mà cơ chất gắn vào tâm ái nhân bằngmột phản ứng hóa học
nào đó giữa tâm ái nhân ở trung tâm hoạt động enzyme với một nhóm hóa học
ở vị trí liền kề với liên kết nhị dương trong cơ chất. Dưới ảnh hưởng của trung
tâm hoạt động của enzyme sẽ dần dần làm tăng mức độkhuyết điện tử vốn đã
tồn tại trước đó, bằng cách tạo liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí
gần gũi với liên kết nhị dương. Nhờ vậy, làm cho sựphân bố điện tử trong
phân tử bị thay đổi theo chiều hướng cần thiết khiến cho liên kết nhị dương
được tăng cường và có thể tương tác với các ái nhâncủa trung tâm hoạt động
của enzyme và tiến hành làm yếu liên kết, dẫn đến liên kết bị thủy phân khi
có yếu tố nước tham gia.
1.1.2. Thành phần hóa học
Nguyên liệu Artemia giàu acid amin, đặc biệt là cácacid amin không
thay thế rất có lợi cho cơ thể, ngoài ra nguyên liệu có nhiều khoáng, acid
5
béo nên khi thủy phân thu dịch thì dịch thủy phân được coi là sản phẩm có
giá trị dinh dưỡng cao có nhiều tiềm năng sử dụng phục vụ cho con người.
1.1.3. Đặc điểm, tính chất
Thực chất của quá trình sản xuất protein thủy phân chính là quá trình
thủy phân protein để tạo ra các peptid và acid amindưới tác động của hệ
enzyme nội tại và enzyme bổ sung. Một vài peptid từphành phần protein thủy
phân đã được tìm thấy có khả năng chứa chất oxy hóa, và độ hoạt động sinh
học.
1.1.4. Phương pháp sản xuất protein thủy phân
Để sản xuất protein thủy phân người ta thường sử dụng hệ enzyme có
sẵn trong nguyên liệu hoặc bổ sung enzyme để thủy phân protein thành các
phần peptid, acid amin và thu hồi chúng. Trong đó có 2 cách làm, đó là ủ xi lô
và bổ sung enzyme protease.
Phương pháp ủ xi lô: thủy phân nguyên liệu nhờ các enzyme có sẵn
trong nguyên liệu, ngoài ra còn có sự hỗ trợ của acid hữu cơ được bổ sung
vào. Chất lượng của protein thu được theo phương pháp nay chủ yếu phụ
thuộc vào hàm lượng các acid amin.
Trong vài giờ đầu của quá trình thủy phân, lượng acid amin thiết yếu
tăng lên, Tuy nhiên không nên kéo dài giai đoạn thủy phân vì khi đã đạt đến
hiệu suất tối đa, tiếp tục thủy phân trong môi trường acid sẽ làm giảm hiệu
suất của các acid amin thiết yếu. Phương pháp này có ưu điểm là tận dụng
được enzyme protease có sẵn trong bản thân nguyên liệu, phương pháp đơn
giản, không sử dụng máy móc thiết bị phức tạp nên dễ thực hiện.
Phương pháp bổ sung enzyme protease: cũng giống nhưphương pháp ủ
xi lô là lợi dụng hoạt động thủy phân protein của protease để thu hồi protein.
Tuy nhiên, để giảm thời gian thủy phân người ta bổ sung protease với hàm
lượng nhất định để đẩy mạnh tốc độ phản ứng thủy phân.
6
Ngoài ra người ta còn dùng phương pháp thủy phân bằng acid, kiềm.
Người ta thường dung acid HCl 6N dư thừa ở nhiệt độ100-120
o
C trong
khoảng 24 giờ. Sản phẩm chủ yếu thu được là các amino acid tự do ở dạng
hydrogenclograte. Và người ta cũng có thể thu được amino acid bằng cách
thủy phân với NaOH, bằng cách đun nóng trong nhiều giờ. Sản phẩm thu
được hầu hết là các amino acid nhưng đều bị racemichóa.
1.1.5. Giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học
Thành phần của protein thủy phân gồm các peptid và các acid amin khi
sự phân giải protein được gây ra bởi protease nội tại và enzyme bổ sung. Nó
dường như là thành phần của ứng dụng khoa học dinh dưỡng của thủy phân
protein không tinh chế, nó có thể giúp ích chút ít hơn peptid tinh chế từ sự hút
của oligopeptid được tăng lên sự có mặt của đường và amino acid. Hơn nữa
nó cũng cho thấy rằng thủy phân ứng dụng chất chốngoxy hóa cao chủ động
hơn peptid tinh chế. Peptid từ thực phẩm được coi là hợp chất an toàn và có
lợi cho sức khỏe, chúng có cấu trúc đơn giản, có nhiều tính chất ổn định.
Nhiều hơn chúng đưa ra giá trị dinh dưỡng và nhiều chức năng bên cạnh chức
năng chống oxy hóa của chúng. Có sự ức chế quá trình peroxid lipid, lọc sạch
các gốc tự do và kìm hãm sự chuyển đổi ion kim loạicủa các peptid chống
oxy hóa. Khả năng chống oxy hóa của peptid có liên quan kết cấu của chúng,
cấu trúc và tính không ưa nước. Với sự hiện diện ở vị trí thích hợp của các
amino acid cấu thành các peptid trong chuỗi peptid giữ một vai trò quan trọng
trong phạm vi chống oxy hóa của peptid. Liên kết peptid phản ánh cấu trúc rõ
ràng cụ thể của peptid, đồng thời cũng được khẳng định là có ảnh hưởng
phạm vi chất chống oxy hóa. Hình thể của peptid cũng có thể ảnh hưởng đến
hoạt động chống oxy hóa. Có nghiên cứu cho thấy sự thay thế của L- His
bằng D- His trong một peptid chống oxy hóa làm giảmmật độ hoạt động. Họ
đã kết luận vị trí đặt của nhóm imido như chìa khóaảnh hưởng hoạt động


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đặng Văn Hợp (chủ biên), Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Thuần Anh, Vũ
Ngọc Bội (2006), Phân tích kiểm nghiệm thực phẩm thủy sản, NXB
Nông Nghiệp.
2. Đỗ Văn Hoàng (1998), Mô hình kết hợp Artemia nuôi trên ruộng muối
Sóc Trăng và Bạc Liêu, luận án Thạc Sĩ ngành nuôi trồng thủy sản, Nha
Trang.
3. Đỗ Văn Ninh (2003), tối ưu hóa quá trình phân giải protein của
proteaza trong thịt cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein
được thủy phân,luận án tiến sĩ kỹ thuật.
4. Nguyễn Thị Thảo (2010), Nghiên cứu tách chiết chất chống oxy hóa từ
rong Nâu và ứng dụng trong bảo quản lạnh thịt bò, đồ án tốt nghiệp tốt
nghiệp Đại Học ngành CBTS, Nha Trang 09/2010.
5. Nguyễn Thị Thắm (2009), Nghiên cứu thủy phân protein trong phế liệu
đầu tôm bằng enzyme Protease,đồ án tốt nghiệp Đại Học ngành CBTS,
Nha Trang 08/2009.
6. Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng Minh (1996), Công nghệ chế biến
thực phẩm thủy sản tập II, NXB Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh.
7. Lý Thị Minh Hương (2008), nghiên cứu sản xuất chế phẩm dịch thủy
phân từ thịt hàu biển dùng trong thực phẩm, luận văn thạc sĩ kỹ thuật.
8. Triệu Minh Hiển ( 2009), nghiên cứu chế biến bột đạm từ sinh khối
Artremia bằng phương pháp sử dụng enzyme, luận án thạc sĩ kỹ thuật.
Internet
9. http://www.ykhoanet.com/cactacgia/nguyenyduc/anhuongtuoivang/08_4
_Antioxidant.htm
42
10. http://www.ntu.edu.vn/bomon/cnchebien/default.aspx?file=privateres/bo
mon/cnchebien/file/thong%20tin%20khoa%20hoc.htm.aspx)
11. http://vietbao.vn/Suc-khoe/Bo-sung-cac-chat-chong-oxy-hoa-tu-rau-trai/45164543/248/
12. http://vietbao.vn/The-gioi-giai-tri/Oxy-hoa-can-benh-thoi-dai/55082094/403/http://zennova.vn/Khoe-Va-Dep/Goc-Tu-Do-Va-Lao-Hoa/95/Index.aspx
13. http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=Pages1&go=pa
ge&pid=46
14. http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/4368881