Thạc Sĩ Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của một số cây thuốc ở An Giang và thành phần các ho

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: Hóa phân tích
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NĂM 2011

MỤC LỤC ( Luận văn dài 186 trang)


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
MỞ ĐẦU


TỔNG QUAN
1.BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG . 1
1.1. Khái niệm . 1
1.2. Phân loại . 1
1.2.1. Bệnh đái tháo đường loại 1 . 1
1.2.2. Bệnh đái tháo đường loại 2 . 1
1.3. Tác hại 3
1.3.1. Các biến chứng cấp tính . 3
1.3.2. Các biến chứng mãn tính . 4
1.4. Phương pháp điều trị . 4
2. ENZYM α-GLUCOSIDASE . . 6
2.1. Sơ lược về enzym 6
2.2. Chất ức chế enzym . 6
2.3. Động học phản ứng xúc tác của enzym . 8
2.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzym 8
2.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất nền . 9
2.3.3. Ảnh hưởng của chất ức chế 12
2.3.3.1. Ức chế cạnh tranh . 12
2.3.3.2. Ức chế kháng cạnh tranh 14
2.3.3.3. Ức chế không cạnh tranh 16
2.3.3.4. Ức chế hỗn tạp . 18
2.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ . 20
2.3.5. Ảnh hưởng của pH . 20
2.4. Giới thiệu về enzym α-glucosidase 21
2.5.Tác nhân ức chế enzym α-glucosidase . 22
2.5.1. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase từ tổng hợp . 22
2.5.2. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase cô lập tự nhiên 25
3. TỔNG QUAN VỀ CÂY NÚC NÁC . 30
3.1. Tên gọi 30
3.2. Mô tả thực vật . 31
3.3. Phân bố . 32
3.4. Dược tính 33
3.5. Thành phần hóa học . 33
3.5.1. Các hợp chất cô lập từ lá 33
3.5.2. Các hợp chất cô lập từ quả . 34
3.5.3. Các hợp chất cô lập từ hạt 35
3.5.4. Các hợp chất cô lập từ vỏ thân . 36
3.5.5. Các hợp chất cô lập từ vỏ rễ . 37
3.6. Hoạt tính sinh học . 40
3.6.1. Kháng khuẩn 40
3.6.2. Chống lại tác nhân gây đột biến . 40
3.6.3. Chống ung thư . 40
3.6.4. Ức chế tăng sinh tế bào 40


MỤC TIÊU ĐỀ TÀI THỰC NGHIỆM
1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ . 43
1.1. Hóa chất 43
1.2. Thiết bị 43
1.3. Dụng cụ . 44
2. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE 44
2.1. Điều chế cao thô 44
2.1.1. Nguyên liệu 44
2.1.2.Ly trích 49
2.2. Thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase . 49
2.2.1. Nguyên tắc . 49
2.2.2.Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase . 51
2.2.3.Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym α-glucosidase . 53
2.3. Khảo sát động học xác định kiểu ức chế và hằng số ức chế Ki . 53
2.3.1.Khảo sát thời gian phản ứng . 54
2.3.2.Khảo sát nồng độ chất nền 55
2.3.3.Xác định kiểu ức chế 55
2.3.4.Xác định hằng số ức chế Ki . 57
3. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ THÂN CÂY NÚC NÁC . 59
3.1. Ly trích cao thô 59
3.2. Cô lập hợp chất 60
3.2.1.Cô lập chất từ phân đoạn A . 60
3.2.2.Cô lập chất từ phân đoạn B . 61
3.2.3.Cô lập chất từ phân đoạn C và D . 61


KẾT QUẢ
1. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA CÂY THUỐC AN GIANG . 65
1.1. Kết quả điều chế cao thô . 65
1.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của 40 mẫu cây . 66
2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA THÂN CÂY NÚC NÁC 69
2.1. Cô lập và xác định cấu trúc các hợp chất . 69
2.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất . 72
2.2.1. Hợp chất (1) . 72
2.2.2. Hợp chất (2) . 74
2.2.3. Hợp chất (3) . 77
2.2.4. Hợp chất (4) . 80
2.2.5. Hợp chất (5) . 81
2.2.6. Hợp chất (6) . 84
2.2.7. Hợp chất (7) . 87
2.2.8. Hợp chất (8) . 90
2.2.9. Hợp chất (9) . 91
2.2.10. Hợp chất (10) . 92
2.2.11. Hợp chất (11) . 94
2.2.12. Hợp chất (12) . 96
2.3. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất cô lập được 98
2.4. Nghiên cứu động học ức chế enzym α-glucosidase của oroxylosid 99
2.4.1. Khảo sát thời gian phản ứng . 99
2.4.2. Khảo sát nồng độ chất nền 100
2.4.3. Xác định kiểu ức chế 101
2.4.4. Xác định Ki 103


KẾT LUẬN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Tóm tắt ảnh hưởng của kiểu ức chế lên Vmax và Km 20
Bảng 1.2: Sự phân loại khoa học của cây núc nác 30
Bảng 2.1: Danh mục các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài 45
Bảng 2.2: Thể tích các hóa chất trong quy trình thử hoạt tính 52
Bảng 2.3: Thể tích các dung dịch khảo sát nồng độ chất nền 55
Bảng 2.4: Tóm tắt dạng đồ thị các kiểu ức chế 55
Bảng 2.5: Thể tích các dung dịch nghiên cứu động học . 57
Bảng 2.6: Tóm tắt cách xác định Ki các kiểu ức chế . 57
Bảng 3.1: Bảng hiệu suất cao trích được của các mẫu cây thuốc nghiên cứu . 65
Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính của chất đối chứng dương . 66
Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính của 40 mẫu cây thuốc An Giang . 66
Bảng 3.4: Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các cao phân đoạn thô . 69
Bảng 3.5: Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các cao phân đoạn thu được từ cao EtOAc . 70
Bảng 3.6: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (1) trong dung môi cloroform-d1
Bảng 3.7: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (1) trong dung môi cloroform-d1 và hợp chất oroxylin A trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 74
Bảng 3.8: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (2) trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 76
Bảng 3.9: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (2) trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 và hợp chất oroxylosid trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 76
Bảng 3.10: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (3) trong dung môi aceton-d6
Bảng 3.11: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (3) trong dung môi aceton-d6 và hợp chất hispidulin trong dung môi metanol-d4 . 79
Bảng 3.12: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (4) trong dung môi
aceton-d6 và hợp chất apigenin trong dung môi aceton-d6 81
Bảng 3.13: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương
quan HMBC của hợp chất (5) trong dung môi aceton-d6 . 83
Bảng 3.14: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (5) trong dung môi
aceton-d6 và hợp chất ficusal trong dung môi aceton-d6 . 84
Bảng 3.15: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương
quan HMBC của hợp chất (6) trong dung môi aceton-d6 . 86
Bảng 3.16: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (6) trong dung môi
aceton-d6 và hợp chất balanophonin trong dung môi cloroform-d1 . 86
Bảng 3.17: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương
quan HMBC của hợp chất (7) trong dung môi aceton-d6 . 89
Bảng 3.18: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (7) trong dung môi
aceton-d6 và hợp chất 2-(1-hydroxymetyletyl)-4H,9H-naphto[2,3-b]furan-4,9-dion
trong dung môi cloroform-d1 89
Bảng 3.19: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (8) trong dung môi
dimetyl sulfoxid-d6 và hợp chất acid salicylic trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 91
Bảng 3.20: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (9) trong dung môi
aceton-d6 và hợp chất acid p-hydroxybenzoic trong dung môi aceton-d6 92
Bảng 3.21: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (10) trong dung môi
metanol-d4 và hợp chất acid protocatechuic trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 93
Bảng 3.22: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (11) trong dung môi
cloroform-d1 và hợp chất isovanillin trong dung môi cloroform-d1
. 95
Bảng 3.23: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương
quan HMBC của hợp chất (12) trong dung môi aceton-d6 . 97
Bảng 3.24: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (12) trong dung môi
aceton-d6 và hợp chất β-hydroxypropiovanillon trong dung môi cloroform-d1 98
Bảng 3.25: Bảng kết quả hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của 10 hợp chất cô
lập từ ruột thân cây núc nác 98
Bảng 3.26: Kết quả đo mật độ quang theo thời gian khảo sát 99
Bảng 3.27: Thể tích các dung dịch nền và giá trị mật độ quang đo được tương ứng
Bảng 3.28: Kết quả mật độ quang theo sự thay đổi nồng độ chất nền và chất ức chế


Bảng 3.39: Bảng xử lý số liệu mẫu control và mẫu ức chế 102
Bảng 3.30: Giá trị Kht/Vht ứng với các nồng độ ức chế khác nhau 103


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Phân loại bệnh tiếu đường 2
Hình 1.2: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E] . 9
Hình 1.3: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất nền . 11
Hình 1.4: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-
Burk . 11
Hình 1.5: Kiểu ức chế cạnh tranh 12
Hình 1.6: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver- Burk khi có ức chế cạnh tranh
Hình 1.7: Đồ thị biểu diễn Kct theo khi có chất ức chế cạnh tranh để xác định Ki


Hình 1.8: Kiểu ức chế kháng cạnh tranh 14
Hình 1.9: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver- Burk khi có ức chế kháng cạnh tranh
Hình 1.10: Đồ thị biểu diễn 1/Vkct và 1/Kkct theo khi có chất ức chế kháng cạnh tranh để xác định Ki
Hình 1.11: Kiểu ức chế không cạnh tranh . 16
Hình 1.12: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-Burk khi có ức chế không cạnh tranh
Hình 1.13: Đồ thị biểu diễn 1/Vkoct theo khi có chất ức chế không cạnh tranh để xác định Ki
Hình 1.14: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo
Lineweaver-Burk khi có ức chế hỗn tạp 19
Hình 1.15: Đồ thị biểu diễn Kht/Vht theo khi có chất ức chế hỗn tạp để xác định Ki
Hình 1.16: Hợp chất disaccarit ức chế enzym α-glucosidase 22
Hình 1.17: Các hợp chất iminosugar ức chế enzym α-glucosidase . 23
Hình 1.18: Các hợp chất carbasugar và pseudoaminosugar ức chế enzym α- glucosidase
Hình 1.19: Các hợp chất thiosugar ức chế enzym α-glucosidase 24
Hình 1.20: Các hợp chất không có liên kết glycosidic ức chế enzym α-glucosidase
Hình 1.21: Cây núc nác và hoa . 31
Hình 1.22: Quả và hạt cây núc nác 32
Hình 1.23: Các hợp chất cô lập từ lá cây núc nác 34
Hình 1.24: Các hợp chất cô lập từ quả núc nác . 35
Hình 1.25: Các hợp chất cô lập từ hạt cây núc nác 36
Hình 1.26: Các hợp chất cô lập từ vỏ thân cây núc nác 37
Hình 1.27: Các hợp chất cô lập từ vỏ rễ cây núc nác . 39
Hình 2.1: Cấu trúc của acarbose . 52
Hình 2.2: Cấu trúc của acid tannic 52
Hình 2.3: Đường biểu diễn phương trình Lineweaver-Burk . 54
Hình 3.1: Cấu trúc các hợp chất cô lập được từ thân cây núc nác . . 71
Hình 3.2: Cấu trúc của hợp chất (1) 72
Hình 3.3: Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (1) 73
Hình 3.4: Cấu trúc của hợp chất (2) 74
Hình 3.5: Nhóm đường glucuronid của hợp chất (2) . 75
Hình 3.6: Tương quan HMBC của hợp chất (2) 75
Hình 3.7: Cấu trúc của hợp chất (3) 77
Hình 3.8: Tương quan HMBC của hợp chất (3) 78
Hình 3.9: Cấu trúc của hợp chất (4) 80
Hình 3.10: Cấu trúc của hợp chất (5) 81
Hình 3.11: Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (5) 83
Hình 3.12: Cấu trúc của hợp chất (6) 84
Hình 3.13: Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (6) 85
Hình 3.14: Cấu trúc của hợp chất (7) . 87
Hình 3.15: Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (7) 88
Hình 3.16: Cấu trúc của hợp chất (8) 90
Hình 3.17: Cấu trúc của hợp chất (9) . 91
Hình 3.18: Cấu trúc của hợp chất (10) 92
Hình 3.19: Cấu trúc của hợp chất (11) 94
Hình 3.20: Cấu trúc của hợp chất (12) 96
Hình 3.21: Một số tương quan HMBC của hợp chất (12) 97
Hình 3.22: Đồ thị biểu diễn mật độ quang theo thời gian 100
Hình 3.23: Đồ thị biểu diễn mật độ quang theo nồng độ chất nền . 101
Hình 3.24: Đồ thị biểu diễn 1/V0 theo 1/ với các nồng độ ức chế khác nhau 102
Hình 3.25: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của Kht/Vht vào nồng độ chất ức chế . .103


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phản ứng xúc tác enzym trường hợp có 1 chất nền 9
Sơ đồ 1.2: Sơ đồ chuyển hóa đường trong cơ thể 21
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế cao thô 49
Sơ đồ 2.2: Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase . 51
Sơ đồ 2.3: Quy trình khảo sát thời gian phản ứng 54
Sơ đồ 2.4: Quy trình ly trích cao từ thân cây núc nác . 59
Sơ đồ 2.5: Quy trình cô lập chất từ phân đoạn A 62
Sơ đồ 2.6: Quy trình cô lập chất từ phân đoạn B 63
Sơ đồ 3.1: Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase các cây thuốc có IC50 50-100 àM mL-1 . 68


MỞ ĐẦU
Bệnh đái tháo đường với các biến chứng nguy hiểm như bệnh tim mạch, tai biến mạch máu não, mù lòa, suy thận, đoạn chi . đã trở thành nguyên nhân gây tử vong thứ tư ở các nước đang phát triển. Trên thế giới cứ mỗi 10 giây đồng hồ lại có một người chết vì những biến chứng của bệnh đái tháo đường cũng như có hai trường hợp mới được chẩn đoán. Vì vậy, việc nghiên cứu các phương pháp điều trị
bệnh đái tháo đường đang được các nhà khoa học quan tâm. Trong các hướng điều trị bệnh đái tháo đường loại 2, hướng điều trị bằng
cách ức chế hoạt động của enzym α-glucosidase hiện đang được các nhà nghiên cứu quan tâm vì có cơ chế đơn giản, an toàn. Tuy nhiên, những loại thuốc ức chế enzym α-glucosidase đang sử dụng vẫn có nhiều tác dụng phụ, nên nhằm hạn chế những tác dụng phụ và đưa thêm nhiều lựa chọn cho việc điều trị bệnh đái tháo đường, cần phải nghiên cứu thêm các chất ức chế enzym α-glucosidase mới từ nhiều nguồn khác nhau.
Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase, cũng như cô lập được nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính ức chế mạnh. Trong khi đó, Việt Nam có nguồn cây thuốc dồi dào, phong phú, và trong dân gian ta từ lâu đã lưu truyền nhiều bài thuốc chữa bệnh đái tháo đường bằng cây cỏ, thế nhưng chỉ có một vài nghiên cứu về vấn đề này. Tại sao ta không tìm hiểu xem trong nguồn cây thuốc ấy, liệu có cây thuốc nào có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase? Từ đó có thể cô lập được những hợp chất mới có khả năng điều trị bệnh đái tháo đường từ thiên nhiên, đóng góp cho sự phát triển của ngành hóa dược nước ta.