Thạc Sĩ Nghiên cứu hệ gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang

Luận án tiến sĩ năm 2012
Đề tài: Nghiên cứu hệ gen của virus cúm A/H5N1 phân lập từ gà nuôi tại Hậu Giang
Luận án chỉ có tới chương 2 và phần phụ lục, thiếu chương 3

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA . VI
DANH MỤC CÁC BẢNG VIII
DANH MỤC CÁC HÌNH . XI
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: T ỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1. Đại cương về bệnh cúm gia cầm . 4
1.1.1. L ịch sử bệnh cúm gia cầm . 4
1.1.2. Tình hình d ịch cúm gia cầm A/H5N1 tr ên th ế giới 5
1.1.3. Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 ở Việt Nam 7
1.1.4. Nguyên nhân gây bệnh . 9
1.1.5. Cơ chế sinh bệnh 13
1.1.6. Tri ệu chứng lâm sàng . 15
1.1.7. B ệnh tích 16
1.1.8. Chẩn đoán bệnh 18
1.1.9. Phòng ch ống bệnh cúm gia cầm 20
1.2. Sinh h ọc phân tử virus cúm A 24
1.2.1. Hệ gen của virus cúm A 24
1.2.2. Protein c ủa virus - c ấu trúc và chức năng 26
1.2.3. Cơ ch ế phân tử quá tr ình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A 36
1.2.4. Các phương th ức biến đổi kháng nguy ên của virus cúm A . 38
1.3. Ti ến hóa hệ gen virus cúm A/H5N1 . 42
1.3.1. Sự tiến hóa của virus cúm A/H5N1 42
1.3.2. Sự xâm nhập các genotype của virus cúm A/H5N1
vào Vi ệt Nam . 44
1.3.3. Sựbiến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm
kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam . 47
IV
1.4. Ph ản ứng RT -PCR trong nghiên cứu virus cúm A 49
1.5. Một sốnghiên c ứu v ề sinh học phân tử virus cúm A/H5N1 t ạiViệt
Nam 50
1.6. Tầm quan trọng của việc giải m ã h ệ gen virus cúm A/H5N1
54
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN C ỨU 56
2.1. Đối tượng nghi ên cứu 56
2.2. Địa điểm v à thời gian nghi ên c ứu 56
2.3. Nội dung nghiên cứu . 56
2.3.1. Gi ải tr ình t ự toàn b ộ hệ gen chủng virus cúm A/H5N1 (CkHG4)
phân lập từ g à Hậu Giang 56
2.3.2. Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả
h ệ chủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam và thế giới 56
2.4. Vật liệu nghiên cứu . 56
2.4.1. Nguyên li ệu . 56
2.4.2. Dụng cụ v à thi ết bị . 57
2.4.3. Hóa chất . 57
2.4.4. Các dung dịch và môi trường 57
2.5. Phương pháp nghiên cứu 58
2.5.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số . 58
2.5.2. Phương pháp RT-PCR . 59
2.5.3. Phương pháp ki ểm tra sản phẩm RT-PCR . 63
2.5.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR . 63
2.5.5. Phương pháp dòng hóa . 64
2.5.6. Phương pháp giải tr ình t ự . 67
2.5.7. Phương pháp xử lý số liệu 69
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 70
3.1. Kết quả giải m ã hệ gen virus cúm A/H5 N1 chủng CkHG4 . 70
3.1.1. Kết quả tách RNA tổng số . 70
V
3.1.2. Kết quả giải trình t ự các gen kháng nguy ên HA (H5)
và NA (N1) . 71
3.1.2.1. Gi ải trình t ự gen H5 (HA) 71
3.1.2.2. Gi ải trình t ự gen N1 (NA) 73
3.1.3. Kết quả giải trình t ự cá c gen polymerase . 75
3.1.3.1. Gi ải trình t ự gen PB2 75
3.1.3.2. Gi ải trình t ự gen PB1 . 76
3.1.3.3. Gi ải trình t ự gen PA . 77
3.1.4. Kết quả giải trình t ự các gen NP, M và NS . 79
3.1.4.1. Gi ải trình t ự gen NP . 79
3.1.4.2. Gi ải t rình t ự gen M . 79
3.1.4.3. Gi ải trình t ự gen NS . 80
3.2. Phân tích so sánh thành ph ần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của
ch ủng CkHG4 với các chủng của Việt Nam v à th ế giới . 83
3.2.1. Phân tích gen H5 84
3.2.2. Phân tích gen N1 93
3.2.3. Phân tích gen PB2 102
3.2.4. Phân tích gen PB1 và PB1-F2 106
3.2.5. Phân tích gen PA 112
3.2.6. Phân tích gen NP . 117
3.2.7. Phân tích gen M . 120
3.2.8. Phân tích gen NS 124
3.3. Thảo luận chung 131
KẾT LUẬN V À KIẾN NGHỊ . 136
PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề t ài
Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính có t ốc độ lây lan
nhanh, v ới tỷ lệ chết cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh do các phân týp (subtype)
của nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. B ệnh
gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành chăn nuôi của nhiều nước trên thế giới, v à có
khả năng lây nhiễm từ động vật sang người.
Bệnh cúm gia cầm do phân týpH5N1 xuất hiện lần đầu tiên tại Việt Nam
năm 2003 (Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Không, 2004) [3]. Trong một thời
gian r ất ngắn, bệnhcúm gia cầm đã lây lan trên toàn bộ đất nước, hàng triệu gia
cầm bị chết v à tiêu h ủy, gây thiệt hại rất lớn cho nền kinh tế quốc dân ; và t ừ đóđến
nay bệnh xảy ra li ên t ục trở thành m ột vấn đề dịch tễ phức tạp cầ
n giải quyết tại
nư ớc ta.
Virus cúm A là loại viruscó h ệ gen RNA sợi đ ơn âm, bao gồm 8 phân đoạn
gen riêng biệt mang t ên t ừ 1 -8 (hay được gọi theo t ên p rotein mà chúng mã hoá
tổng hợp), mã hoá cho 11 protein khác nhau c ủa virus gồm: PB2, PB1, PB1-F2, PA,
HA, NP, NA, M1, M2, NS1 và NS2 (Murphy và Webster, 1996) [113], (Rabadan
và cs, 2006) [126], được phân chia thành nhiều phân týp khác nhau dựa trên kháng
nguyên HA và NA có trên b ề mặt capsid của hạt virus (de Wit và Fouchier, 2008)
[55].
H5N1 là một phâ n týp thuộc nhóm virus cúm A, loại hình phân týp kháng
nguyên b ề mặt HA là H5 và NA là N1, có độc lực cao gây nhiễm và gây bệnh nặng
n ề ở gia cầm v à c ả trên người (Murphy và Webster, 1996) [113].
Virus cúm A/H5N1 có hệ gen luôn biến đổi, tái tổ hợp biến chủng và thay
đ ổi cấu trúc kháng nguyên để thích ứng gây bệnh (Lê Thanh Hòa và cs, 2004) [7].
Trình tự nucleotide hệ gen là cơ sở để xác lập mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của
các bi ến chủng virus cúm A/H5N1. Kết quả giải mã hệ gen l à nguồn dữ liệu cung
cấpthông tin v ề nguồn gốc xuất xứ, sự tiến hóa của virus, giúp phát hiện những
2
biến chủng mới trong quần thể virus cúm gia cầm.
Thông qua việc giải m ã h ệ gen, so sánh, phân tích tr ình t ự nucleotide và
amino acid có th ể xác định những vùng gen thường biến đổi, vùng gen ổn định làm
cơ sở dữ liệu gen học và protein h ọc của các chủng H5N1 xuất hiện từ những năm
đ ầu tiên tại nước ta làm cơ s ởl ựa chọn loại vaccine thích hợp trong công tác phòng
ch ống dịch cúm gia cầm.
Để có th êm nguồn gen của virus cúm A/H5N1 lưu hành tại Việt Nam, từ đó
làm cơ s ở dữ liệu cho những nghiên c ứu vềgen/h ệ gen của virus cúm A/H5N1 và
nghiên c ứu sản xuất các chế phẩm sinh học thế hệ mới ứngdụng trong chẩn đoán và
phòng b ệnh, chúng tôi ti ến hành đ ề t ài: Nghiên cứu hệ gen của virus cúm A/H5N1
phân l ập từ gà nuôi tại Hậu Giang .
Mục tiêu c ủa đ ề tài
(1) Giải mã được toàn bộ h ệ gen gồm 8 phân đo ạn của một chủng virus cúm
A/H5N1 từ g à nuôi t ại Hậu Giang .
(2) Phân tíchđược một số đặc điểm sinh học phân tử của hệ gennh ằm thu
đư ợc thêm d ữ liệu làm cơ sở cho nghiên cứu vaccine ph òng bệnh
hi ệu quả .
Ý ngh ĩa khoa học của đề tài
- Đây là lu ận ánnghiên cứu khá đầy đủ , có hệ thống v ề sinh học phân tử h ệ
gen virus cúm A/H5N1 ởgà nuôi t ại Hậu Giang .
- Lu ận án là tài li ệu tham khảo tốt phục vụcho giảng dạy v à nghiên cứu khoa
h ọc v ề virus cúm A/H5N1.
Ý ngh ĩa thực tiễn của đề tài
- K ết quả nghiên cứu của đề t ài giúp hiểu biết th êm v ề tính đa dạng của virus
cúm. Trên cơ sở đó góp phần xây dựng phương pháp chẩn đoán
và lựa chọn vaccine
phòng bệnh phùh ợp .
- Kết quả nghiên cứu của đề t ài góp ph ần làm sáng tỏ th êm mối quan hệ
ngu ồn gốc ph ả hệ của virus cúm A/H5N1 phân lập trong những năm đầu ti ên d ịch
xuất hiện ở vùng đồng bằng sông Cửu Long.
3
Nh ững đ óng góp m ới của đề tài
(1) Gi ải tr ình t ự v à n
ghiên cứu hoàn ch ỉnh , có hệ thống hệ genc ủa một chủng
virus cúm A/H5N1 thuộc thể độc lực cao (HPAI) phân lập từgà t ại Hậu Giang năm
2005 (ký hiệu chủng là CkHG4)trong đ ợt dịch cúm gia cầm lần đầu tiên xuất hiện ồ
ạt ở Việt Nam.
(2) Đã phân tích đặc điểm gen học hệ gen/gen của chủng CkHG4, bao gồm
trình t ự nucleotide/amino acid, cấu trúc, đồng nhất/tương đồng ; so sánh với các
ch ủng trong v ùng và thế giới.
(3) Đã làm sáng tỏ mối quan hệ phả hệ, nguồn gốc và tương quan gen/hệ gen
của virus cúm A/H5N1 cư ờng độc d òn g Qu ảng Đông (chủng CkHG4), góp phần
hiểu biết thêm về virus cúm A/H5N1 gây bệnh và đóng góp dữ liệu cho đối chiếu
v ới các vaccine sử dụng tại Việt Nam.
(4) Đã kh ảo sát v à xác định được các cặp mồi sử dụng có hiệu quả để thu
nhận và giải tr ình t ự hệ gen củ a virus cúm A/H5N1 thuộc những phân d òng l ần đầu
tiên xuất hiện v à hiện còn l ưu hành tại Việt Nam .
4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM
Cúm gia cầm (avian influenza) đúng hơn là cúm loài chim, là bệnh truyền
nhi ễm cấp t ính c ủa loài chim, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae
gây ra. Đây là nhóm virus có biên độ chủ rộng, được phân chia th ành nhi ều phân
týp khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus
(de Wit và Fouchier, 2008) [55]. Nhóm virus cúm A có 16 phân týp HA (t ừ H1 đến
H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11],
(Horimoto và Kawaoka, 2005) [78]. S ự tái tổ hợp (reassortment) giữa các phân týp
HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân týp k hác nhau về độc tính và khả
năng gây bệnh.
Dịch cúm gia cầm do virus cúm A phân týp H5N1 thể độc lực cao xuất hiện
ở vùng Quảng Đông, Trung Quốc năm 1996 và đã lan ra h ơn 60 nước trên thế giới
ở châu Á, châu Âu v à châu Phi (Duan và cs, 2008) [59], gây nhiều thiệt hại kinh tế
do gia c ầm bị chết hoặc tiêu huỷ nhằm kiểm soát dịch, được chứng minh là có kh ả
năng lây nhiễm từ động vật sang người, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (Lê
Thanh Hòa và cs, 2004) [7]. B ệnh cúm gia cầm A/H5N1 lần đầu tiên xuất hiện tại
Việt Nam v ào cuối năm 2003, từ đó đến nay bệnh xảy ra liên tục, đang là v ấn đề
d ịch tễ phức tạp do xuất hiện nhiều phân dòng virus mới và là dịch bệnh cần phải
giải quyết tại nước ta (Nguyen và cs, 2008) [116], (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11].
Virus cúm A/H5N1 đang lưu hành ở nhiều nước, thường xuy ên gây bệnh cho gia
cầm và người, là nguy cơ gây đại dịch trên toàn thế giới.
1.1.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm
Bệnh cúm gà (avian influenza) còn có tên là dịch hạch g à (Fowl Plague) l ần
đ ầu tiên được phát hiện ở Ita lia vào năm 1878. Nhưng mãi tới năm 1901 mới xác
đ ịnh đ ược yếu tố gây bệnh là căn nguyên siêu nhỏ có khả năng qua màng lọc và tới
năm 1955 mới xác định được chính xác nguy ên nhân gây b ệnh cúm gia cầm là virus
5
cúm týp A thông qua kháng nguyên bề mặt H7N1 v à H7N7 (Lê Văn Năm, 2004)
[18].
Đại dịch giống như cúm được xác nhận lần đầu tiên vào năm 1580. Từ đó
trở đi, trên toàn th ế giới đ ã có 31 đại dịch được ghi nhận (Nguy ễn Văn Thanh v à cs,
2007) [24], (Bùi Quý Huy, 2007) [12]. Trong th ế kỷ XX đã x ảy ra các đạ i d ịch cúm
trên người như d ịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 –1919 do virus cúm A/H1N1,
d ịch cúm châu Á năm 1957 –1958 do virus cúm A/H2N2, d ịch cúm Hồng Kông
năm 1968 –1969 do virus cúm A/H3N2, và d ịch cúm Nga năm 1977 do virus cúm
A/H1N1 (Lê Thanh Hòa và cs, 2006) [9].
Ở Việt Nam bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 được phát hiện năm
2003 (Trương Văn Dung và Nguy ễn Viết Không, 2004) [3] .
1.1.2 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên th ế giới
Cúm A/H5N1 là một loại virus có độc lực cao v à gây b ệnh tr ên n gư ời trong
các đợt dịch cúm gia cầm những năm 1996 -2008, đ ặc biệt ác liệt là do virus cúm
A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây ra kể từ
năm 2003 cho đến nay (Lê Thanh Hòa và cs, 2008) [11]. Ch ủng virus cúm A/H5N1
đư ợc phát hi ện lần đầu ti ên gây bệnh dịch tr ên gà t ại Scotland vào năm 1959 và có
th ể gọi chủng virus này là virus cúm A/H5N1 cổ điển. Từ đó đến nay, cấu trúc
thành phần gen v à kháng nguyên mi ễn dịch của H5 và N1 đã có nhi ều thay đổi
(Horimoto và Kawaoka, 2006) [79]. Sau gần 40 năm không phát hiện, cúm A/H5N1
xuất hiện tại Quảng Đông (1996), Hồng Kông (1997) với những biến đổi sâu sắc,
không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng v à gây chết người bệnh. Có thể coi
dòng virus cúm A/H5N1 từ 1996 đến nay l à cúm A/H5N1 hiện đại mới xuất hiện
(de Jong và Hien, 2006) [54]. Đ ặc biệt từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1
gây ra dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng ch ục
quốc gia trên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi
(Lê Thanh Hòa và cs, 2008)
[11], (Duan và cs, 2008) [59]. Virus cúm A/H5N1 giai đo ạn 2003 -2008, cơ b ản về
cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng tính gây bệnh, loài vật chủ nhiễm bệnh, tính
kháng nguyên-miễn dịch và m ức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác
6
v ới nhiều biến chủn g H5N1 trư ớc đây (Subbarao và Luke, 2007) [140], (Zhao và cs,
2008) [164]. T ừ đầu năm 1997 đến tháng 5 năm 2005, virus cúm A/H5N1 chỉ giới
h ạn ở vùng Đông Nam Á (Chen và cs, 2005) [45]. T ừ cuối 2005, cúm A/H5N1 sau
khi lây nhiễm cho chim hoang dã ở v ùng hồ Thanh Hải (Qinghai Lake), Trung
Quốc bắt đầu lan truyền sang phía Tây, lan sang một số nước vùng Trung Á, trong
đó có Nga, rồi tr àn ngập Đông Âu v à xâm nh ập vào các nước v ùng Ti ểu Á, bao
g ồm Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc -Trung Phi, đặc biệt Ai Cập v à Nigiêria là các nư ớc
ch ịu thiệt hại nhiều nhất (Salzberg và cs, 2007) [129].
Tính đến 2008, tổng số có trên 60 nước và vùng lãnh th ổ bùng phát dịch cúm
gia cầm, hàng trăm triệu gia cầm bị chết v à tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho
ngành chăn nuôi và kinh tế (Duan và cs, 2008) [59], (Lê Thanh Hòa và cs, 2008)
[11].
Bảng 1.1: Tổng số tr ường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo cáo
cho WHO t ừ tháng 12/2003 đến 6/7/2012