Thạc Sĩ nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển asp trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU . 1
Chương 1 - TỔNG QUAN . 4
1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ . 4
1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản . .6
1.3. Đại cương về axít domoic (DA) . .8
1.3.1. Tính chất hóa lý. .8
1.3.2. Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể: . 8
1.3.3. Độc tính của DA . .9
1.4. Một số phương pháp phân tích DA . .9
1.4.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột . .10
1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS) 11
1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương
pháp LC-MS/MS trong phân tích DA . .12
1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột . .12
1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng . .12
1.6. Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5] . .12
1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản . .13
1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) . 15
1.6.3. Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng . 23
1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột . .23
1.7. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký . .26
1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: . .27
1.7.2. Chiết pha rắn SPE: . .27
Chương 2 - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . .29
2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài . 29
2.2. Mô hình thực nghiệm . 29
2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: . 29
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ: . .29
2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: . .30
2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu: . .30
2.5. Xác định các thông số tối ưu: . 31
2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS . 31
2.5.2. Cột: . .31
2.5.3. Pha động và chế độ gradient: . .32
2.5.4. Dung môi chiết: . .32
2.5.5. Thiết lập bảng mẫu: . 32
2.5.6. Tính toán : . 33
2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính: . .33
2.5.8. Giới hạn phát hiện của phương pháp: . 33
2.5.9. Độ lặp lại của phương pháp: . .34
2.5.10. Độ thu hồi của phương pháp: . .34
2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể . .35
Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN . .36
3.1. Xác định các thông số tối ưu: . 36
3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS . .36
i




3.1.2. Pha động và chương trình chạy gradient. .40
3.1.3. Dung môi chiết: . .45
3.2. Khoảng tuyến tính: . .47
3.3. Giới hạn phát hiện của phương pháp: . .49
3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp: . 49
3.5. Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể . .51
3.6. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp: . .52
3.7. Qui trình phân tích Axít domoic. .54
3.7.1. Phạm vi áp dụng: . .54
3.7.2. Nguyên tắc: . .54
3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch: . .54
3.7.4. Chuẩn bị mẫu: . 57
3.7.5. Tiến hành thử nghiệm: . .58
3.7.6. Đảm bảo chất lượng . 60
3.7.7. Tính toán kết quả: . 60
KẾT LUẬN . 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO . .62
PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN .
PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU .
PHỤ LỤC 3. ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH .
PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ .
PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ
.BẰNG HPLC -UV .


MỞ ĐẦU
Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất
nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên
trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD. Một nửa xuất khẩu thủy sản trên thế giới
bắt nguồn từ các nước đang phát triển trong khi 80% nhập khẩu thuộc về các
nước phát triển. Xuất khẩu ròng từ các nước đang phát triển đạt mức 25,4 tỷ
USD trong năm 2008. Các sản phẩm từ thủy sản là một nguồn thu ngoại tệ
quan trọng tại các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, thủy sản ngày càng
đóng vai trò thiết yếu vào kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Sau hơn 1 năm
gia nhập WTO, ngành thủy sản Việt Nam đã có một bước tiến nhảy vọt trong
công tác xuất khẩu thủy sản, chỉ trong năm 2007 sản lượng thủy sản cả nước
ước đạt 3,9 triệu tấn với kim ngạch xuất khẩu 3,75 tỷ USD, trong đó sản
phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ cũng chiếm một tỷ trọng đáng kể. Đến năm
2008, kim ngạch xuất khẩu thủy sản nước ta đã vượt ngưỡng 4 tỷ USD.
Một trong các thị trường nhập khẩu lớn của ngành thủy sản Việt Nam
là Liên minh Châu Âu (EU). Theo quy định của Ủy ban liên minh Châu Âu,
để một nước ngoài khối EU được phép xuất khẩu thủy sản vào EU phải đảm
bảo các yếu tố: (i) Hệ thống văn bản quy pham pháp luật và năng lực cơ quan
quản lý an chất lượng vệ sinh toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU là
tương đương. (ii) Hệ thống phòng kiểm nghiệm tham gia vào công tác kiểm
tra, chứng nhận chất lượng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của nước xuất
khẩu và EU tương đương nhau. (iii) Bắt buộc phải thực hiện các chương trình
giám sát dư lượng độc hại trong thủy sản nuôi và giám sát điều kiện đảm bảo
vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ. (iv) Đồng thời thủy sản phải
được phân tích các chỉ tiêu theo quy định của EU trước khi xuất khẩu cùng
với các đòi hỏi nghiêm ngặt về kỹ thuật phân tích.
Như vậy, thực hiện chương trình giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh
vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ là một điều kiện tiên quyết giúp Việt
Nam được phép xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ vào EU. Hai nội dung liên
1




quan đến kỹ thuật đóng vai trò chính trong việc thực hiện chương trình này là
định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả năng sinh độc tố) và
phân tích độc tố sinh học biển (ASP- độc tố gây mất trí nhớ, DSP - độc tố gây
tiêu chảy, PSP - độc tố gây liệt cơ).
Dạng tồn tại chính của độc tố gây mất trí nhớ (ASP) là axit Domoic có
công thức cấu tạo:
Ngành thủy sản hiện nay đang rất cần có những qui trình phân tích phù
hợp theo yêu cầu của các thị trường nhập khẩu giúp cơ quan chức năng kiểm
soát các hóa chất độc hại nói chung và đặc biệt là các độc tố có mối nguy gắn
liền với loài (độc tố sinh học biển với loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, Histamine
đối với họ cá thu ngừ ). Vì vậy, cần thiết phải xây dựng qui trình phân tích
để xác định Axít domoic trong nhuyễn nhể 2 mảnh vỏ. Ngoài một số nghiên
cứu của một số tổ chức khoa học hoặc tiêu chuẩn ở nước ngoài với phương
pháp được sử dụng xác định hàm lượng Axít domoic bằng kỹ thuật HPLC-
UV và LC/MSn, phương pháp sinh hóa trên chuột thì hiện nay Việt nam chưa
có tiêu chuẩn riêng về phương pháp thử cho loại độc tố này. Vì vậy vấn đề
nghiên cứu, cải tiến phương pháp đã được nghiên cứu trên thế giới để có thể
áp dụng xác định hàm lượng DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, phù hợp với
điều kiện của Việt nam (nền mẫu phân tích, thiết bị, hóa chất môi trường )
là rất cần thiết. Nó giúp các phòng thử nghiệm ứng dụng thực tế giúp cơ quan
chức năng kiểm soát chặt chẽ dư lượng độc tố này để đáp ứng yêu cầu xuất
khẩu.
Với khuôn khổ luận văn thạc sĩ chuyên ngành hóa phân tích, chúng tôi
tập trung tìm ra điều kiện phân tích tối ưu trên thiết bị LC-MS/MS hiện có tại
2




phòng thí nghiệm để “Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP
(Axít domoic) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc
ký lỏng ghép 2 lần khối phổ” và thực hiện phân tích trên một số mẫu nhuyễn
thể tại các vùng thu hoạch tại Việt Nam.