Thạc Sĩ Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP (Axít domoic) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằn

MỞ ĐẦU
Theo ước tính của Tổ chức nông lương (FAO), tổng kim ngạch xuất nhập khẩu các sản phẩm thủy sản trong năm 2008 của thế giới lần đầu tiên trong lịch sử đã vượt 100 tỷ USD. Một nửa xuất khẩu thủy sản trên thế giới bắt nguồn từ các nước đang phát triển trong khi 80% nhập khẩu thuộc về các nước phát triển. Xuất khẩu ròng từ các nước đang phát triển đạt mức 25,4 tỷ USD trong năm 2008. Các sản phẩm từ thủy sản là một nguồn thu ngoại tệ quan trọng tại các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, thủy sản ngày càng đóng vai trò thiết yếu vào kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Sau hơn 1 năm gia nhập WTO, ngành thủy sản Việt Nam đã có một bước tiến nhảy vọt trong công tác xuất khẩu thủy sản, chỉ trong năm 2007 sản lượng thủy sản cả nước ước đạt 3,9 triệu tấn với kim ngạch xuất khẩu 3,75 tỷ USD, trong đó sản phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ cũng chiếm một tỷ trọng đáng kể. Đến năm 2008, kim ngạch xuất khẩu thủy sản nước ta đã vượt ngưỡng 4 tỷ USD. Một trong các thị trường nhập khẩu lớn của ngành thủy sản Việt Nam là Liên minh Châu Âu (EU). Theo quy định của Ủy ban liên minh Châu Âu, để một nước ngoài khối EU được phép xuất khẩu thủy sản vào EU phải đảm bảo các yếu tố: (i) Hệ thống văn bản quy pham pháp luật và năng lực cơ quan quản lý an chất lượng vệ sinh toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU là tương đương. (ii) Hệ thống phòng kiểm nghiệm tham gia vào công tác kiểm tra, chứng nhận chất lượng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm của nước xuất khẩu và EU tương đương nhau. (iii) Bắt buộc phải thực hiện các chương trình giám sát dư lượng độc hại trong thủy sản nuôi và giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ. (iv) Đồng thời thủy sản phải được phân tích các chỉ tiêu theo quy định của EU trước khi xuất khẩu cùng với các đòi hỏi nghiêm ngặt về kỹ thuật phân tích. Như vậy, thực hiện chương trình giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể 2 mảnh vỏ là một điều kiện tiên quyết giúp Việt Nam được phép xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ vào EU. Hai nội dung liên

2
quan đến kỹ thuật đóng vai trò chính trong việc thực hiện chương trình này là định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả năng sinh độc tố) và phân tích độc tố sinh học biển (ASP- độc tố gây mất trí nhớ, DSP – độc tố gây tiêu chảy, PSP – độc tố gây liệt cơ). Dạng tồn tại chính của độc tố gây mất trí nhớ (ASP) là axit Domoic có công thức cấu tạo:
Ngành thủy sản hiện nay đang rất cần có những qui trình phân tích phù hợp theo yêu cầu của các thị trường nhập khẩu giúp cơ quan chức năng kiểm soát các hóa chất độc hại nói chung và đặc biệt là các độc tố có mối nguy gắn liền với loài (độc tố sinh học biển với loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, Histamine đối với họ cá thu ngừ ). Vì vậy, cần thiết phải xây dựng qui trình phân tích để xác định Axít domoic trong nhuyễn nhể 2 mảnh vỏ. Ngoài một số nghiên cứu của một số tổ chức khoa học hoặc tiêu chuẩn ở nước ngoài với phương pháp được sử dụng xác định hàm lượng Axít domoic bằng kỹ thuật HPLC- UV và LC/MSn, phương pháp sinh hóa trên chuột thì hiện nay Việt nam chưa có tiêu chuẩn riêng về phương pháp thử cho loại độc tố này. Vì vậy vấn đề nghiên cứu, cải tiến phương pháp đã được nghiên cứu trên thế giới để có thể áp dụng xác định hàm lượng DA trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ, phù hợp với điều kiện của Việt nam (nền mẫu phân tích, thiết bị, hóa chất môi trường ) là rất cần thiết. Nó giúp các phòng thử nghiệm ứng dụng thực tế giúp cơ quan chức năng kiểm soát chặt chẽ dư lượng độc tố này để đáp ứng yêu cầu xuất khẩu. Với khuôn khổ luận văn thạc sĩ chuyên ngành hóa phân tích, chúng tôi tập trung tìm ra điều kiện phân tích tối ưu trên thiết bị LC-MS/MS hiện có tại phòng thí nghiệm để “Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP (Axít domoic) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ” và thực hiện phân tích trên một số mẫu nhuyễn thể tại các vùng thu hoạch tại Việt Nam.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1 Chương 1 - TỔNG QUAN .4 1.1. Hiện tượng thủy triều đỏ .4 1.2. Độc tố sinh học biển trong thủy sản 6 1.3. Đại cương về axít domoic (DA) 8 1.3.1. Tính chất hóa lý. .8 1.3.2. Nguồn tích tụ DA trong nhuyễn thể: 8 1.3.3. Độc tính của DA .9 1.4. Một số phương pháp phân tích DA .9 1.4.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột 10 1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS) 11 1.5. Ưu và nhược điểm của các phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS trong phân tích DA .12 1.5.1. Phương pháp sinh hóa trên chuột 12 1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng 12 1.6. Đại cương về sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ [2], [5] 12 1.6.1. Một số định nghĩa và phương trình cơ bản .13 1.6.2. Những thành phần cơ bản của hệ thống LC-MS/MS (Waters) 15 1.6.3. Loại hợp chất phù hợp phân tích bằng sắc ký lỏng 23 1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách của các chất trong cột 23 1.7. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký .26 1.7.1. Chiết lỏng - lỏng: 27 1.7.2. Chiết pha rắn SPE: 27 Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1. Nội dung nghiên cứu của đề tài .29 2.2. Mô hình thực nghiệm 29 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: .29 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ: 29 2.3.2. Thuốc thử, hóa chất: .30 2.4. Thông tin về mẫu nghiên cứu: .30 2.5. Xác định các thông số tối ưu: 31 2.5.1. Xác định các thông số tối ưu cho MS .31 2.5.2. Cột: 31 2.5.3. Pha động và chế độ gradient: 32 2.5.4. Dung môi chiết: .32 2.5.5. Thiết lập bảng mẫu: 32 2.5.6. Tính toán : .33 2.5.7. Khảo sát khoảng tuyến tính: .33 2.5.8. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .33 2.5.9. Độ lặp lại của phương pháp: .34 2.5.10. Độ thu hồi của phương pháp: 34 2.5.11. Thực nghiệm xác định DA trên mẫu nhuyễn thể 35 Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36 3.1. Xác định các thông số tối ưu: 36 3.1.1. Xác định các thông số tối ưu của MS/MS 36

ii
3.1.2. Pha động và chương trình chạy gradient 40 3.1.3. Dung môi chiết: .45 3.2. Khoảng tuyến tính: 47 3.3. Giới hạn phát hiện của phương pháp: .49 3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp: .49 3.5. Thực nghiệm xác định DA trên nhuyễn thể 51 3.6. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp: 52 3.7. Qui trình phân tích Axít domoic .54 3.7.1. Phạm vi áp dụng: 54 3.7.2. Nguyên tắc: .54 3.7.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch: .54 3.7.4. Chuẩn bị mẫu: .57 3.7.5. Tiến hành thử nghiệm: 58 3.7.6. Đảm bảo chất lượng 60 3.7.7. Tính toán kết quả: .60 KẾT LUẬN 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN .1 PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU .4 PHỤ LỤC 3. ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH 13 PHỤ LỤC 4. SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ .19 PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ .BẰNG HPLC –UV