Tiến Sĩ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con (Lates calcarifer Bloch 1790) đối với vi khuẩn Streptoc

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2014

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CÁM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
DANH MỤC CÁC HÌNH viii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG LUẬN 4
1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌNH HÌNH NUÔI CÁ CHẼM 4
1.1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm. 4
1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới 5
1.1.2.1 Sản lượng cá chẽm nuôi trên thế giới 5
1.1.2.2 Các hình thức nuôi cá chẽm thương phẩm6
1.1.3 Tình hình nuôi cá chẽm tại Việt Nam7
1.1.4 Các bệnh thường gặp ở cá chẽm nuôi7
1.1.4.1 Bệnh do virus7
1.1.4.2 Bệnh do vi khuẩn8
1.1.4.3 Bệnh do kí sinh trùng10
1.2 BỆNH DO Streptococcus iniae TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN11
1.2.1 Tình hình dịch bệnh Streptococcus iniae trong nuôi trồng thủy sản11
1.2.2 Dấu hiệu bên ngoài của bệnh do Streptococcus inae13
1.2.3 Giải phẫu bệnh lý cá nhiễm Streptococcus iniae13
1.2.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn S. iniae14
1.2.5 Biện pháp phòng và trị bệnh do Streptococcus iniae16
1.3 HỆ THỐNG MIỄN DỊCH Ở CÁ XƯƠNG20
1.3.1 Miễn dịch tự nhiên20
1.3.1.1 Hàng rào vật lý và hóa học20
1.3.1.2 Hàng rào tế bào21
1.3.1.3 Hàng rào thể dịch22
1.3.2 Đáp ứng miễn dịch thích ứng 24
1.3.2.1 Hàng rào tế bào trong đáp ứng miễn dịch thích ứng 24
1.3.2.2 Hàng rào thể dịch trong đáp ứng miễn dịch thích ứng 25
1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của cá 27
1.3.3.1 Các yếu tố ngoại cảnh 27
1.3.3.2 Các yếu tố nội tại 28
1.3.3.3 Các yếu tố phái sinh 28

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34
2.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 34
2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.34
2.3 SƠ ĐỒ KHỐI NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (Hình 2.1) 34
2.4 PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHÂN TÍCH MẪU 34
2.4.1 Phân lập và xác định đặc điểm vi khuẩn Streptococcus iniae. 34
2.4.1.1 Phân lập vi khuẩn S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa34
2.4.1.2 Xác định độc lực của vi khuẩn phân lập37
2.4.1.3 Kiểm tra độ nhạy kháng sinh của các chủng S. iniae phân lập 38
2.4.1.4 Nghiên cứu phương thức xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm 38
2.4.1.5 Tính tương đồng kháng nguyên của các chủng phân lập 39
2.4.2 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của các chẽm đối với vi khuẩn S. iniae 41
2.4.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae và ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch này. 41
2.4.2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với tế bào vi khuẩn S. iniae bất hoạt bằng formalin (Formalin Killed Cell - FKC)43
2.4.3 Nghiên cứu sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm49
2.4.4 Phương pháp phân tích số liệu49
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU50
3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Streptococcus iniae PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM50
3.1.1 Phân lập vi khuẩn S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa50
3.1.1.1 Tình hình dịch bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa50
3.1.1.2 Đặc điểm phân loại của các chủng vi khuẩn phân lập52
3.1.2 Độc lực của vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá bệnh54
3.1.3 Độ nhạy của S. iniae với các loại kháng sinh57
3.1.4 Con đường cảm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm59
3.1.5 Tính tương đồng kháng nguyên của các chủng vi khuẩn gây bệnh đã phân lập62
3.2 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM ĐỐI VỚI VI KHUẨN S. iniae64
3.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae bất hoạt và ảnh hưởng của β-glucan đến đáp ứng này64
3.2.1.1 Hoạt tính thực bào và chỉ số thực bào64
3.2.1.2 Nồng độ lysozyme trong huyết thanh của cá chẽm66
3.2.1.3 Khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm67
3.2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với tế bào vi khuẩn S. iniae bất hoạt bằng formalin (FKC)70
3.2.2.1 Biến động hàm lượng kháng thể đặc hiệu trong máu cá thí nghiệm sau khi tiêm FKC70
3.2.2.2 Đặc điểm protein kháng nguyên của vi khuẩn S. iniae74
3.2.2.3 Hiệu quả bảo vệ của tế bào vi khuẩn bất hoạt (FKC) đối với bệnh do Streptococcus iniae gây ra ở cá chẽm76
3.3 SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA TUYẾN ỨC80
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 85
TÀI LIỆU THAM KHẢO87
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, thành công của những mô hình thử nghiệm nuôi cá chẽm ở các ao nuôi tôm hoang hóa đã khẳng định cá chẽm là đối tượng có hiệu quả kinh tế cao. Đặc biệt từ năm 2005, khi đã tìm được thị trường xuất khẩu sản phẩm cá chẽm phi lê đông lạnh, nghề nuôi cá chẽm thương phẩm phát triển nhanh chóng ở một số tỉnh như Bến Tre, Cà Mau, Bạc Liêu, Khánh Hòa Cùng với sự phát triển về diện tích và mức độ thâm canh của nghề nuôi cá chẽm, dịch bệnh trên đối tượng nuôi mới này bắt đầu xuất hiện, gây thiệt hại ở một số cơ sở nuôi cá thương phẩm. Trong đó, bệnh truyền nhiễm đóng một vai trò hết sức quan trọng.
Nghiên cứu của Wendover (2010) về các bệnh quan trọng ở cá chẽm nuôi tại Châu Á cho biết trong tất cả các bệnh thường gặp ở cá chẽm, bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra là bệnh phổ biến nhất [190].
Streptococcus iniae lần đầu tiên được biết đến vào năm 1976, khi Pier và Madin công bố kết quả định danh chủng vi khuẩn đã được phân lập từ ổ viêm dưới da cá heo nước ngọt sông Amazon nuôi tại San Francisco từ năm 1972 [137], từ đó đến nay, dịch bệnh cứ liên tục xảy ra trên khắp các vùng nuôi trên thế giới và ở hầu hết cá loài cá nuôi như cá bơn Paralichthys olivaceus, cá thơm Plecoglossus altivelis, cá hồi Oncorhynchus rhodurus, cá dìa xám Siganus fuscescens, cá chẽm Lates calcarifer, cá điêu hồng Oreochromis sp., cá chẽm châu Âu Dicentrarchus labrax [121, 122, 127, 173] . gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế cho người nuôi.
Sử dụng kháng sinh là một trong những biện pháp có hiệu quả trong việc trị bệnh do S. iniae gây ra. Tuy nhiên, việc sử dụng thường xuyên kháng sinh sẽ làm gia tăng các dòng vi khuẩn kháng thuốc. Nghiên cứu của Aoki và các cộng sự đã chứng minh sự gia tăng các dòng liên cầu khuẩn kháng thuốc [13]. Probiotic hay một số chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu như inositol, levalmisole hay β-glucan cũng đã được sử dụng trong việc phòng trị bệnh do S. iniae gây ra ở cá. Tuy nhiên, hiệu quả của việc phòng trị bệnh bằng các phương pháp này không cao và rất khác nhau ở các nghiên cứu khác nhau [101, 136, 145, 149, 191].
Vaccine là sự lựa chọn tốt nhất trong việc kiểm soát bệnh do S. iniae gây ra. Tuy nhiên, đôi khi việc sử dụng vaccine không mang lại hiệu quả như mong muốn do những thay đổi mạnh mẽ của vi khuẩn nhằm thích nghi với điều kiện môi trường cho phép chúng thay đổi cấu trúc protein kháng nguyên. Do đó, mặc dù đã có một số loại vaccine phòng bệnh do S. iniae gây ra nhưng những nghiên cứu để tạo ra những loại vaccine có hiệu lực cao vẫn hết sức cần thiết. Mặt khác, khả năng tiếp nhận vaccine và chất kích thích miễn dịch còn phụ thuộc vào từng loài cá, thời điểm sử dụng và phương pháp dẫn truyền. Nếu cá giống bị phơi nhiễm với một loại kháng nguyên nào đó quá sớm thì thay vì kích thích hệ thống miễn dịch sinh kháng thể, hiện tượng vô cảm miễn dịch xuất hiện và việc sản sinh kháng thể không xảy ra khi cá tiếp xúc lại với kháng nguyên này. Vì vậy việc chủng vaccine quá sớm cho cá giống có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng.
Từ thực tiễn nêu trên, đề tài: ”Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con (Lates calcarifer Bloch 1790) đối với vi khuẩn Streptococcus iniae” được thực hiện.
Mục tiêu của đề tài:
Cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng các biện pháp phòng bệnh sớm cho cá chẽm bằng phương pháp miễn dịch học
Các nội dung chính của đề tài:
1.Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa
2.Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae
3.Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae
Đánh giá hiệu quả của việc sử dụng vi khuẩn bất hoạt trong phòng bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm.
Nghiên cứu sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu này đã bổ sung các hiểu biết về hệ miễn dịch và đáp ứng miễn dịch của cá chẽm (Lates calcarifer) bao gồm sự phát triển hoàn thiện của tuyến ức, cơ quan lympho trung ương đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu; đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thể hiện qua hoạt tính của đại thực bào và lysozyme; và đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu khi bị hoạt hóa bởi kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus iniae.
Ý nghĩa thực tiễn: Các kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu ứng dụng các biện pháp miễn dịch học nhằm phòng bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá chẽm nuôi tại Việt Nam bao gồm việc sử dụng các chế phẩm kích ứng miễn dịch không đặc hiệu (immunostimulants) và liệu pháp vaccine, góp phần phát triển nghề nuôi cá chẽm tại Việt Nam theo hướng bền vững, an toàn, giảm thiểu rủi ro, giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường do việc sử dụng kháng sinh và hóa chất để phòng trị bệnh cho cá.
Tính mới của công trình: Đây là công bố đầu tiên về hệ miễn dịch của cá chẽm và các đáp ứng miễn dịch của cá chẽm tại Việt Nam. Đồng thời, đây cũng là công bố đầu tiên trên thế giới về sự phát triển hoàn thiện của tuyến ức của cá chẽm (Lates calcarifer) được thực hiện bằng phương pháp mô học.
3