Tiến Sĩ Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicill

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC . iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH MỤC HÌNH . ix
DANH MỤC BẢNG xii
MỞ ĐẦU . . 1
1. Đặt vấn đề . 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Những đóng góp mới của luận án 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1. Nấm Lecanicillium lecanii 4
1.2. Chitinase 5
1.2.1. Nguồn gốc của chitinase . 6
1.2.2. Phân loại chitinase 7
1.2.3. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase . 9
1.2.4. Cơ chế phản ứng của chitinase . 12
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase . 14
1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase 16 iv
1.3. Ứng dụng của nấm L. lecanii và chitinase . 18
1.3.1. Trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo vệ môi trường 18
1.3.2. Trong lĩnh vực y học 22
1.3.3. Trong lĩnh vực công nghệ sinh học 23
1.4. Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase . 24
1.4.1. Trên thế giới . 24
1.4.2. Ở Việt Nam . 28
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31
2.1. Vật liệu và hóa chất . 31
2.1.1. Chủng giống . 31
2.1.2. Thiết bị . 31
2.1.3. Hóa chất . 31
2.1.4. Dung dịch và đệm 32
2.1.5. Môi trường nuôi cấy . 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu 33
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy 33
2.2.2. Phương pháp hóa sinh 35
2.2.3. Tinh sạch chitinase . 37
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính và độ
bền của chitinase tự nhiên và tái tổ hợp .

39
2.2.5. Các phương pháp sinh học phân tử 42
2.2.6. Phương pháp thử nghiệm . 46
2.2.7. Xử lý số liệu . 48 v
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 49
3.1. Sàng lọc, kiểm tra và khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase
từ nấm L. lecanii .

49
3.1.1. Sàng lọc chủng nấm L. lecanii sinh tổng hợp chitinase cao . 49
3.1.2. Kiểm tra chủng nấm L. lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA . 49
3.1.3. Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase 52
3.2. Tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của chitinase từ chủng
nấm L. Lecanii 43H .

57
3.2.1. Tinh sạch chitinase . 57
3.2.2. Đánh giá tính chất lý hóa của chitinase từ chủng nấm L. lecanii
43H .

59
3.3. Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H 66
3.4. Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rChit trong
nấm men P. pastoris X33

70
3.4.1. Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nấm men . 70
3.4.2. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P. pastoris . 71
3.4.3. Tinh sạch rChit . 76
3.4.4. Đánh giá tính chất lý hóa của rChit từ nấm men P. pastoris X33 78
3.5. Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và
bào tử từ nấm L. lecanii .

84
3.5.1. Ảnh hưởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây
trồng .

84
3.5.2. Ảnh hưởng của rChit tới khả năng phát triển của rệp 86 vi
3.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm . 87
3.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm 88
3.5.5. Khả năng diệt rệp của chủng nấm L. lecanii 43H 89
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 92
1. KẾT LUẬN 92
2. KIẾN NGHỊ . 92
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN . 93
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 94
DANH MỤC PHỤ LỤC . 113

vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tiếng Anh Tiếng Việt
BLAST Basic local alignment search tool Phần mềm so sánh trình tự
bp Base pair Cặp bazơ
cDNA Complement DNA DNA tạo ra từ mRNA
Chit Gene encoding chitinase Gen mã hóa chitinase
CMC Cacboxyl methyl cellulose Cacboxyl methyl cellulose
DEPC Diethylpyrocarbonate Diethylpyrocarbonate
DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic
DNase Deoxyribonuclease Enzyme thủy phân DNA
dNTPs 2-Deoxynucleoside 5-
triphosphate
Các nucleotide
ĐC Control Đối chứng
IPTG Isopropyl-beta-D-
thiogalactopyranoside
Isopropyl-beta-D-
thiogalactopyranoside
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid Axit ethylenediamine tetraacetic
EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide
kb Kilo base Kilo base
kDa Kilo Dalton Kilo Dalton
M Marker Thang chuẩn
OD Optical density Mật độ quang
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen
RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic viii
RNase Ribonuclease Enzyme thủy phân RNA
RT-PCR Reverse transcription polymerase
chain reaction
Phản ứng khuếch đại gen
rChit Recombinante chitinase Chitinase tái tổ hợp
SDS-
PAGE
Sodium dodecyl sulfate
Polyacrylamide gel
electrophoresis
Điện di protein
Taq Thermus aquaticus Thermus aquaticus
TBE Tris boric acid EDTA Tris boric acid EDTA
TE Tris EDTA Tris EDTA
TEMED N,N,N,N-
Tetramethylethylenediamine
N,N,N,N-
Tetramethylethylenediamine
v/v Volume/volume Thể tích/thể tích
w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích
ix
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nấm C. immitis . 10
Hình 1.2. Cấu trúc của chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. A-471 . 11
Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của chitinase B từ vi khuẩn S. mecescens . 12
Hình 1.4. Cơ chế thủy phân β-chitin bởi chitinase A từ vi khuẩn
B. circulans .

13
Hình 2.1. Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo phương pháp
Miller

36
Hình 2.2. Các bước tinh sạch chitinase 38
Hình 2.3. Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo
Bradford

39
Hình 2.4. Đồ thị Lineawever-Burk 40
Hình 2.5. Sơ đồ mô tả vị trí gắn của gen Chit vào genome của nấm men
P. pastoris X33 .

46
Hình 3.1. Hoạt tính chitinase của 8 chủng nấm L. lecanii . 49
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng nấm
L. lecanii 43H; Sản phẩm Plasmid và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng
XhoI và XbaI


50
Hình 3.3. Trình tự đoạn gen 28S rRNA từ chủng nấm L. lecanii 43H;
Cây phân loại trình tự gen 28S rRNA từ chủng nấm L. lecanii 43H với
các loài khác .


51
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ nuôi cấy đến khả
năng sinh tổng hợp chitinase .

52
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù và nguồn nitơ đến x
khả năng sinh tổng hợp chitinase 54
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và pH nuôi cấy lên khả năng
sinh tổng hợp chitinase

55
Hình 3.7. Hình ảnh điện di SDS-PAGE của chitinase tinh sạch từ chủng
nấm L. lecanii 43H và hoạt tính chitinase của các phân đoạn qua cột
DEAE-Sephadex A-50 trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất chitin huyền phù
0,5%



58
Hình 3.8. Nhiệt độ và pH thích hợp của chitinase 60
Hình 3.9. Độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase 61
Hình 3.10. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính
chitinase .

64
Hình 3.11. Phân tích TLC các sản phẩm thủy phân chitin bởi chitinase . 66
Hình 3.12. Kết quả nhân dòng gen Chit từ DNA hệ gen . 66
Hình 3.13. Trình tự gen Chit và amino acid suy diễn từ L. lecanii 43H . 67
Hình 3.14. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự gen Chit của chủng
L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank

68
Hình 3.15. Kết quả nhân dòng gen Chit từ mRNA 69
Hình 3.16. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự amino acid của rChit
từ L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank

70
Hình 3.17. Kết quả thiết kế cấu trúc vector biểu hiện pPChit . 70
Hình 3.18. Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rChit trong P. pastoris
X33 .

71
Hình 3.19. Khả năng sinh tổng hợp rChit của chủng tái tổ hợp khi được
cảm ứng ở các nồng độ methanol khác nhau

73
Hình 3.20. Khả năng sinh tổng hợp rChit ở các khoảng thời gian khác
nhau

74 xi
Hình 3.21. Điện di SDS-PAGE của rChit tinh sạch từ P. pastoris X33 77
Hình 3.22. Nhiệt độ và pH thích hợp của rChit . 79
Hình 3.23. Độ bền nhiệt và độ bền pH của rChit . 80
Hình 3.24. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính
rChit .

83
Hình 3.25. Ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. oxysporum và R. solani
bởi chitinase .

86
Hình 3.26. Sợi nấm của R. solani và F. oxysporum được xử lý với nước
và với chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H

86
Hình 3.27. Hỗn hợp chitin của rệp được xử lý với nước và rChit từ nấm
men P. pastoris X33 .

87
Hình 3.28. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm của
bào tử nấm L. lecanii 43H .

89
Hình 3.29. Mô hình lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm và
biểu đồ thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nấm L. lecanii
43H


91