Luận Văn Nghiên cứu đặc điểm và phân loại vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập được từ tôm hùm ở

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Nghiên cứu đặc điểm và phân loại vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập được từ tôm hùm ở Khánh Hòa


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN . i
MỤC LỤC .ii
DANH MỤC BẢNG . iv
DANH MỤC HÌNH . v
DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT vi
LỜI MỞ ĐẦU 2
Chương I. TỔNG QUAN 4
1.1. Bacteriocin . 4
1.1.1 Khái niệm . 4
1.1.2 Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin 4
1.1.3 Phân loại . 6
1.1.4 Tính chất của bacteriocin 13
1.1.5 Cơ chế hoạt động của bacteriocin 15
1.1.6 Sinh tổng hợp bacteriocin . 16
1.2. Tôm hùm . 19
1.2.1 Phân bố . 20
1.2.2 Tập tính . 20
1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng 21
1.2.4 Đặc điểm sinh sản . 22
1.2.5 Giá trị của tôm hùm 22
1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của bacteriocin 23
Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 28
2.1 Nguyên liệu 28
2.1.2 Mẫu tôm hùm 28
2.1.3 Chủng chỉ thị 28
2.1.4 Môi trường hóa chất và thuốc thử . 28
2.1.5 Thiết bị chuyên dụng 29
2.2 Phương pháp nghiên cứu 30
2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật . 32
2.2.2 Tuyển chọn chủng sinh bacteriocin . 34
2.2.3 Xác định đặc điểm của chủng vi khuẩn sinh bacteriocin . 38
Chương III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44
3.1 Phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu tôm Hùm 44
3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng phân lập . 45
3.3 Xác định hoạt tính bacteriocin . 47
3.4 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn 48
3.5 Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn 50
3.5.1 Khả năng chịu muối 50
3.5.2 Thử catalase 51
3.5.3 Tính di động 52
3.5.4 Khả năng sinh hơi . 53
3.6 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử . 53
Chương IV : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 54
4.1 Kết luận . 54
4.2 Kiến nghị . 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 55
PHỤ LỤC . 58
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại I 5
Bảng 1.2 : Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại II 6
Bảng 1.3: Phân loại bacteriocin theo Jack [16] . 9
Bảng 1.4: Bacteriocin lớp IIc theo phân loại của Klaenhammer [20] 12
Bảng 1.5: Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp
bởi vi khuẩn 14
Bảng 3.1: Chủng vi khuẩn phân lập được . 44
Bảng 3.2: Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn 46
Bảng 3.4: Khả năng chịu muối của N14 . 50
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc của nisin 7
Hình 1.2 : Cấu trúc sakacin P . 10
Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của bacteriocin . 16
Hình 1.4: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm I . 18
Hình 1.5: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm II 19
Hình 1.6: Tôm hùm Bông 22
Hình 2.1: Quy trình thực hiện 31
Hình 2.2: Trình tự pha loãng 32
Hình 2.3: Quy trình thử tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô với chủng chỉ thị 35
Hình 2.4: Vùng kháng khuẩn của dịch bacteriocin trên đĩa petri 36
Hình 2.5 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính bacteriocin . 37
Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định đặc điểm vi khuẩn . 38
Hình 3.1: Các chủng vi khuẩn ở nồng độ 10-3 44
Hình 3.2: Kết quả của 12 chủng nổi bật đối kháng với chủng Bacillus B1.1 45
Hình 3.3 : Thử nghiệm với enzyme proteinase K và α-chymotripsin 48
Hình 3.4 : Hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn N14 49
Hình 3.5 : Khả năng chịu muối của chủng N14 51
Hình 3.6 : Khả năng sinh catalase của N14 52
Hình 3.7 : Khả năng di động của chủng N14 52
Hình 3.8 : Khả năng sinh hơi của chủng N14 . 53
vi
SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT
STT Kí hiệu viết tắt Nghĩa
1 TSB Tryptone Soya Broth
2 TSA Tryptone Soya Agar
3 BC Bacterial Cellulose
4 LAB Lactic Acid Bacteria
5 ATP Adenosine Triphosphate
6 DNA Acid Deoxyribo Nucleic
7 HPK Histidine protein kinase
8 RR Response regulator
LỜI MỞ ĐẦU
Vào thời kỳ khai sinh ra vi sinh học hiện đại ngày nay, nhiều nhà khoa học
đã nghiên cứu và phát hiện ra chất kháng sinh. Từ thế kỷ 17, một thầy thuốc Hoàng
gia Anh đã biết cách chữa bệnh bằng cách dùng rêu áp lên vết thương, hay dùng
mẫu bánh mì để chữa trị thương tích. Đến những năm của thế kỷ 18, thuật ngữ ―chất
kháng sinh‖ lần đầu tiên được Pasteur và Joubert sử dụng để mô tả hiện tượng kìm
hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh,
và một số nhà khoa học khác đã phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của một vài
chủng vi sinh vật. Vào năm 1929, khi Alexander Fleming tìm ra thuốc kháng sinh
penicillin từ nấm Penicillium notanum, có khả năng ức chế vi khuẩn sự sinh trưởng
của các loại vi khuẩn, được ứng dụng để chữa trị các bệnh nhiễm trùng trên phạm vi
rộng.
Việc tìm ra thuốc kháng sinh của Alexander Fleming đã mở ra bước ngoặc
mới cho y học loài người. Chỉ với một số lượng rất nhỏ nhưng hiệu quả tiêu diệt vi
sinh vật của penicillin rất cao. Thuốc kháng sinh không chỉ được ứng dụng trong
điều trị bệnh cho người, mà còn dùng điều trị bệnh cho vật nuôi, tăng trọng cho vật
nuôi và cả trong bảo quản thực phẩm (như chlotetracycllin dùng để bảo quản thịt;
tetracycline, oromycine để bảo quản sản phẩm nhằm ngăn chặn quá trình thối rữa
của thịt cá, tôm). Tuy nhiên do lạm dụng quá mức kháng sinh đã dẫn đến khả năng
kháng thuốc ở vi sinh vật nên việc nghiên cứu chất kháng khuẩn để ứng dụng trong
bảo quản thực phẩm cần phải đi theo một hướng mới, hiệu quả hơn.
Không những thế, trong những năm gần đây, khi người tiêu dùng đã nhận
thức rõ hơn về tác động của phụ gia thực phẩm đối với sức khỏe và chuộng các loại
thực phẩm chế biến không bổ sung chất bảo quản hóa học tổng hợp vì tính an toàn
cho thực phẩm. Và từ yêu cầu cao về chất lượng, tính an toàn của thực phẩm từ phía
người tiêu dùng cũng như những yêu cầu nghiêm ngặt của chính phủ về an toàn
thực phẩm trong sản xuất, chế biến, bảo quản đã thúc đẩy nghiên cứu rộng rãi các
chất có khả năng bảo quản thực phẩm có nguồn góc tự nhiên.
Xuất phát từ những yêu cầu đó, việc tiếp tục tìm ra những chất kháng khuẩn
mới trở nên quan trọng trong lĩnh vực y dược và chăn nuôi, và trong công nghệ thực
phẩm. Một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng bacteriocin, một nhóm các hợp chất có
bản chất là peptide, nguồn gốc từ vi sinh vật và có khả năng kháng khuẩn mà không
gây ra tác động kháng thuốc ở vi sinh vật. Ngoài ra, bacteriocin cũng không gây dị
ứng cho con người, an toàn với sức khỏe. Đó là một sự lựa chọn được xem là có
nhiều ưu điểm và hiệu quả nhất. Vì thế, tôi chọn tiến hành nghiên cứu đề tài
“ Nghiên cứu đặc điểm và phân loại vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin
phân lập được từ tôm hùm ở Khánh Hòa ”, giúp làm phong phú thêm bộ sưu tập
chủng vi sinh vật sinh chất kháng khuẩn, tạo ra nhiều sự lựa chọn cho việc tuyển
chọn chủng, và hiểu được đặc tính của các chủng này để tăng khả năng sinh
bacteriocin.
Đề tài nhằm các mục đích chính sau đây:
- Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng kháng khuẩn từ tôm hùm.
- Sàng lọc các chủng vi sinh vật phân lập từ tôm hùm có khả năng sinh
bacteriocin.
- Xác định các đặc điểm của vi sinh vật sàng lọc được.
- Định danh vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập được bằng
phương pháp sinh học phân tử.
Chương I. TỔNG QUAN
1.1. Bacteriocin
Nghiên cứu đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình nghiên cứu
của Gratia và cộng tác viên vào năm 1925 về khả năng kháng khuẩn của
Escherichia coli (colicin V) và thuật ngữ bacteriocin không xuất hiện cho đến
những năm 1950. Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của
colicin, đó là một chất sinh tổng hợp gây tử vong, phổ hoạt động hẹp bị giới hạn ở
những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất. Ba chủng vi khuẩn Gram (+) được
nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp.;Listeria sp. và
Staphylococcus sp. Các nghiên cứu trong những năm 1980 đã cho thấy có sự gia
tăng đáng kể về số lượng các công bố trên bacteriocin. Từ thời điểm này bắt đầu
bùng nổ những nghiên cứu bacteriocin, định hướng như một chất kháng khuẩn an
toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm[12],[23].
1.1.1 Khái niệm
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là peptide hay protein được tổng
hợp trên ribosome ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương để chống lại vi khuẩn
khác có quan hệ gần gũi với chúng. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra bacteriocin nào
thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị
ứng trong con người và vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym
proteinase, lipase.
1.1.2 Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin
Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm hoặc vi khuẩn Gram
dương với những đặc điểm :
- Bacteriocin của vi khuẩn gram âm: gồm nhiều loại khác nhau về kích thước,
nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch.
Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương.
- Bacteirocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở
vi khuẩn gram âm. Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn gram âm ở chỗ là: việc tạo
bacteriocin không cần thiết phải gây chết vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp
bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm .
Những nghiên cứu trước đây về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn
Gram âm, điển hình là E. coli sinh tổng hợp colicin. Tuy nhiên những nghiên cứu
về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương cũng đã được tiến
hành và đã có nhiều báo cáo cung cấp những thông tin về vấn đề này. Ba chủng vi
khuẩn Gram dương được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là
Bacillus sp.;Listeria sp. và Staphylococcus sp.
Ngày nay thì các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được nghiên cứu
nhiều hơn, do tính ưu việt của bacteriocin này dùng trong bảo quản thực phẩm là an
toàn với người sử dụng, không độc với tế bào nhân chuẩn, bị phân hủy bởi
proteinase trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh hưởng đến quần xã sinh vật trong ruột người.
Thêm vào đó chúng hoạt động trong khoảng pH rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây
hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên màng tế bào vi khuẩn nên không gây
ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh và được mã hóa bởi các gen nằm trên
plasmid nên thuận tiện cho thao tác di truyền.
Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng có hoạt
tính kháng các loại vi sinh vật khác. Đặc tính này là do vi khuẩn lactic sinh acid hữu
cơ và sinh bacteriocin kháng khuẩn kháng nấm.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
 Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Thị Hồng Tuyết (2004). ―Nghiên cứu bcateriocin sản xuất bởi
Lactobacillus acidophilus NrrlB – 2092‖. Luận văn thạc sĩ Sinh học,
ĐHQG TpHCM.
2. Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly, Huỳnh Xuân Phong, Đại
học Cần Thơ. ―Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh
chất kháng khuẩn‖. Tạp chí Khoa học 2011 : số 19a 176-184.
3. Nguyễn Đức Hùng, Lê Đình Hùng, Huỳnh Lê Tâm (2004). ―Sổ tay
kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản‖. Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà
Nội.
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty(2005). ―Vi
sinh vật học‖. Nhà xuất bản giáo dục.
5. Nguyễn Thị Đà, Hoa Thị Minh Tú, Lê Thanh Bình (2008). ―Một số
tính chất của bcteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic phân lập từ sữa
bò tươi‖. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 46, số 6, 2008, Tr. 33-34.
6. Nguyễn Thị Bích Thủy (2004). ―Một số dẫn liệu về ảnh hưởng của các
điều kiện môi trường lên sự sinh trưởng của tôm con (juvenile) tôm hùm
bông (Panulirus ornatus) ở vùng biển miền trung Việt Nam‖. Tuyển tập
các công trình nghiên cứu khao học công nghệ (1984 – 2004), trung tâm
nghiên cứu thủy sản III – nha trang. Tr 73 - 81
7. Nguyễn Thị Bích Thủy(2006). ―Kỹ thuật nuôi tôm hùm. GT kỹ thuật
nuôi giáp xác‖. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh.
8. Trần Linh Thước (2006). ―Phương pháp phân tích vi sinh vật trong
nước, thực phẩm và mĩ phẩm‖. Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội.
56
SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
 Tài liệu tiếng Anh
9. Axelsson L, Holck A (1995). ―The genes involved in production of and
immunity to sakacin A, a bacteriocin from Lactobacillus sake Lb706‖.
J.Bacteriol 177 (8): 2125-37.
10. Broadbent JR, Chou YC, Gillies K, Kondo JK (1989). ―Ninsin
inhitbits several gram – positive, mastitis–causing pathogens‖. J.Dairy Sci,
1989, Dec;72(12) :3342-5.
11. Brötz H and Sahl H-G (2000). ―New insights into the mechanism of
action of lantibiotics—diverse biological effects by binding to the same
molecular target‖. Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2000) 46, 1-6.
46 (1): 1–6. DOI:10.1093/jac/46.1.1. PMID 10882681
12. Desriac F, Defer D, Bourgougnon N, Brillet B, Le Chevalier P, Fleury
Y (2010). ―Bacteriocin as Weapons in the Marine Animal-Associated
Bacteria Warfare: Inventory and Potential Applications as an Aquaculture
Probiotic‖. Marine Drugs 2010 , 8 , 1153-1177, DOI 10.3390/md8041153.
13. Gert N.Moll, Wil N.Konings, Arnold J.M.Driessen (1999). ―Bacteriocin:
mechanism of membrane insertion and pore formation‖. Antonie van
Leeuwenhoek, 76, 185 – 198.
14. H.chen, D.G.Hoover (2003). ―Bacteriocin and their food applications‖.
Comprehensive review in food sience and food safety. 2, 82 – 85.
15. Hühne K, Axelsson L, Holck A, Kröckel L (1996). ―Analysis of the
sakacin P gene cluster from Lactobacillus sake Lb674 and its expression
in sakacin-negative Lb. sake strains". Microbiology (Reading, Engl.)
142(6): 1437–48. PMID 8704983 .
16. Jack RW, Tagg JR, Ray B (1995). ―bacteriocin of gram-positive
bacteria‖. Microbiol Rev 59:171-200
17. Joerger MC, Klaenhammer TR (1986). ―Characterization and
purification of helveticin J and evidence for a chromosomally determined
bacteriocin produced by Lactobacillus helveticus 481‖. J.Bacteriol, 1986
Aug167(2):439-46.
18. Jofré A, Garriga M, Aymerich T (2007). ―Inhibition of Listeria
monocytogenes in cooked ham through active packaging with natural
57
SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
antimicrobials and high-pressure processing‖. J. Food Prot, 70 (11): 2498-502, PMID 18044426.
19. Jose´ L Balcázar, Sara Loureiro, Yolanda J Da Silva, José Pintado
and Miquel Planas (2010). ―Identification and characterization of
bacteria with antibacterial activities isolated from seahorses
(Hippocampus guttulatus)‖. The Journal of Antibiotics (2010) 63, 271–
274, DOI:10.1038/ja.2010.27, published online 26 March 2010.
20. Juan C. Oscáriz, Antonio G. Pisabarro (2001). ―Classification and
mode of action of membrane-active bacteriocin produced by gram positive
bacteria‖. Int. Microbiol (2001) 4: 13-19, DOI 10.1007/s101230100003,
published online 25 August 2001.
21. Katla T, Møretrø T, Sveen I, Aasen IM, Axelsson L, Rørvik LM,
Naterstad K (2002). ―Inhibition of Listeria monocytogenes in chicken
cold cuts by addition of sakacin P and sakacin P-producing Lactobacillus
sakei‖. J.Appl. Microbiol 93 (2): 191-196, DOI : 10.1046/j.1365-2672.2002.01675.x PMID 12147066
22. M.A. Riley, M.A. Chavan (Eds.). ―Bacteriocins ecology and evolution‖
23. Poeta P, Costa D, Sáenz Y, Klibi N, Ruiz-Larrea F, Rodrigues J,
Torres C (2005). ―Characterization of antibiotic resistance genes and
virulence factors in faecal enterococci of wild animals in Portugal‖. J.Vet
Med B Infect Dis Vet Public Health, 2005, Nov;52(9):396-402.
24. Vesterlund S, Paltta J, Lauková A, Karp M, Ouwehand AC (2004).
“Rapid screening method for the detection of antimicrobial substances‖.
J.Microbiol Methods, 2004 , Apr;57(1):23-31.