Tiến Sĩ Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (Glycin

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2015
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU . 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu nghiên cứu . 2
3. Nội dung nghiên cứu 3
4. Những đóng góp mới của luận án . 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án . 4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. VAI TRÒ CỦA BỘ RỄ THỰC VẬT VÀ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG ĐỐI
VỚI TÁC ĐỘNG CỦA HẠN 5
1.1.1. Cây đậu tương và tác động của hạn đối với cây đậu tương . 5
1.1.2. Vai trò của bộ rễ ở cây trồng và ở cây đậu tương . 7
1.2. GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ Ở THỰC VẬT 12
1.2.1. Một số nghiên cứu về gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ . 12
1.2.2. Expansin và cơ chế kéo dài rễ 14
1.3. CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG
NHỜ A.TUMEFACIENS 25
1.3.1. Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong chuyển gen ở cây đậu tương thông qua
A.tumefaciens . 25
1.3.2. Cải thiện khả năng chịu hạn ở cây đậu tương bằng chuyển gen liên quan
đến bộ rễ . 33
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU . 38
2.1.1. Vật liệu thực vật . 38
2.1.2. Các chủng vi khuẩn và các loại vector 39
2.1.3. Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu 39
2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU . 39
2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 39
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu 40
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 40
2.3.1. Phương pháp sinh lý đánh giá sự phát triển bộ rễ . 40
2.3.2. Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen 42
2.3.3. Phương pháp phát triển vector chuyển gen GmEXP1 . 44
2.3.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens . 46
2.3.5. Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen . 51
2.3.6. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu . 53
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 54
3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU
TƯƠNG NGHIÊN CỨU 54
3.1.1. Sự kéo dài rễ chính của đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo . 54
3.1.2. Thể tích bộ rễ đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo 54
3.1.3. Khối lượng khô của bộ rễ đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo 57
3.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmEXP1 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG
ĐẬU TƯƠNG 59
3.2.1. Đặc điểm của gen GmEXP1 (cDNA) phân lập từ một số giống đậu
tương 59
3.2.2. Sự đa dạng của trình tự vùng mã hoá gen EXP1 ở một số loài thực vật . 67
3.3. PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN GmEXP1 69
3.3.1. Tạo cấu trúc chứa gen đích GmEXP1 . 70
3.3.2. Gắn cấu trúc chứa gen GmEXP1 vào vector pCB301 tạo vector chuyển
gen GmEXP1 72 3.4. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GEN GmEXP1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ 76
3.4.1. Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây thuốc lá nhờ
A.tumefaciens . 76
3.4.2. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuốc lá ở thế
hệ T0 . 78
3.4.3. Phân tích và đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển
GmEXP1 trên cây thuốc lá ở thế hệ T1 . 85
3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG GEN CHUYỂN GmEXP1 . 95
3.5.1. Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây đậu tương nhờ
A.tumefaciens . 95
3.5.2. Phân tích các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 97


Chương 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU . 100
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 109
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN . 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO 112
PHỤ LỤC 128

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng chiến lược ở nhiều
quốc gia, giữ vị trí quan trọng thứ tư sau lúa, ngô và lúa mì. Hạt đậu tương có giá trị
dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao. Hạt có hàm lượng protein từ 32% - 52%, chứa
nhiều amino acid không thay thế (lysin, triptophan, metionin, leucin .) và các
vitamin (B1, B2, C, D, E, K .) cần thiết cho cơ thể người và động vật. Hạt đậu
tương được sử dụng trực tiếp làm thực phẩm cho con người, làm thức ăn cho gia
súc, là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và là mặt hàng xuất khẩu có giá
trị cao trên thế giới. Đậu tương là cây trồng cải tạo đất. Thân lá để lại trong đất
nhiều chất dinh dưỡng, rễ có nhiều nốt sần do vi khuẩn Rhizobium cộng sinh có khả
năng cố định đạm giúp cải tạo độ phì và sử dụng bền vững nguồn tài nguyên đất.
Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán kéo dài, lượng mưa không đều ở
các vùng vào các thời điểm trong năm là một khó khăn lớn cho sản xuất nông
nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ . Ngoài những tác động trực tiếp
lên quá trình canh tác, biến đổi khí hậu còn làm thu hẹp diện tích sản suất nông
nghiệp. Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc nên thường xuyên
khan hiếm về nguồn nước gây khó khăn cho canh tác đối với nhiều loại cây trồng,
trong đó có đậu tương. Theo thống kê của FAO, năng suất đậu tương trên thế giới
giảm khoảng 11,13% trong ba năm trở lại đây. Cây đậu tương có thời gian sinh



trưởng ngắn, khả năng thích ứng rộng, có thể bố trí phù hợp với nhiều cơ cấu cây
trồng trong sản xuất, nhưng lại thuộc nhóm cây trồng chịu hạn kém. Khô hạn có ảnh
hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển ở tất cả các giai đoạn của cây đậu tương.
Thiếu nước ở giai đoạn trước khi hoa nở làm giảm tới 40% năng suất hạt đậu tương
so với ảnh hưởng của hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa. Chính vì vậy chọn tạo giống
đậu tương có khả năng chịu hạn tốt là vấn đề cấp thiết và mang tính thời sự trên thế
giới cũng như ở Việt Nam. Trong điều kiện khô hạn, sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào và sự
phát triển mạnh của bộ rễ sẽ giúp cây thu được nhiều nước từ các lớp đất sâu, đảm
bảo quá trình sinh trưởng và phát triển bình thường của thực vật. Thực vật có bộ rễ
phát triển kéo dài, khả năng đâm xuyên tốt, có thể vươn tới những lớp đất sâu sẽ có
cơ hội thu nhận được nhiều nước hơn trong điều kiện khô hạn. Đồng thời, sự điều
chỉnh thẩm thấu trong tế bào chóp rễ bằng những cơ chế tích luỹ chất khô, tăng
cường các kênh vận chuyển tích cực, tăng cường hô hấp và trao đổi ion . cũng giúp
thực vật dễ dàng lấy được lượng nước ít ỏi trong đất. Mặt khác, trong điều kiện hạn,
thực vật còn có một loạt các phản ứng kết hợp để tăng cường khả năng chống chịu
với điều kiện hạn như điều chỉnh đóng mở khí khổng, giảm thoát sự thoát hơi nước,
tăng cường tích nước tế bào Trong một loạt những phản ứng nói trên ở thực vật
dưới điều kiện khô hạn của môi trường thì việc nghiên cứu tác động vào sự phát
triển kéo dài rễ, thay đổi cấu trúc và số lượng rễ bên . được xem là biện pháp hữu
hiệu trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương.
Cải thiện đặc tính di truyền thích nghi với khô hạn của cây trồng được xem là
giải pháp quan trọng trong tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu hiện nay. Hướng tiếp
cận nghiên cứu cải thiện sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương đã được quan tâm với
việc sử dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể, lai giống hữu tính, đột biến thực nghiệm và
ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại, trong đó công nghệ gen được coi là biện pháp
có hiệu quả trong nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn cao.
Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu đặc
điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu
tương (Glycine max (L.) Merrill)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu tổng quát
Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1 liên
quan đến sự kéo dài rễ bằng kỹ thuật chuyển gen.
2.2. Mục tiêu cụ thể
(i) Xác định được sự khác biệt về sự phát triển của bộ rễ và sự sai khác về trình tự
nucleotide của gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của một số giống đậu
tương địa phương.