Tiến Sĩ Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của câ

UẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NĂM 2014
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu của đề tài 2
3. Nội dung nghiên cứu .3
4. Những đóng góp mới của luận án .3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1. Cây ngô .5
1.1.1. Sơ lược về cây ngô .5
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô 7
1.1.3. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam .8
1.2. Phản ứng của cây ngô trước tác động của hạn .10
1.2.1. Mối liên quan giữa tác động của hạn và tính chống chịu stress ôxy hóa10
1.2.1.1. Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa .10
1.2.1.2. Các dạng oxy hoạt hóa 12
1.2.1.3. Hệ thống bảo vệ cây trồng khỏi tác động của oxy hóa 13
1.2.2. Cơ sở sinh lý, sinh hoá và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô.14
1.2.2.1. Cơ sở hình thái, sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn .14
1.2.2.2. Cơ sở sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô .17
1.3. Anthocyanin và vai trò chuyển hóa các dạng oxy hoạt hóa .20
1.3.1. Vai trò của anthocyanin khi thực vật bị hạn .20
1.3.2. Gen điều hoà tổng hợp anthocyanin ở cây ngô 27
1.3.2.1. Nhân tố phiên mã và điều hòa biểu hiện gen .27
1.3.2.2. Nhân tố phiên mã tham gia quá trình tổng hợp anthocyanin .30
1.4. Ứng dụng real- time PCR nghiên cứu mức độ biểu hiện gen tham gia sinh tổng hợp anthocyanin 34

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .40
2.1. Vật liệu nghiên cứu 40
2.2. Địa điểm nghiên cứu, hoá chất và thiết bị .40
2.3. Phương pháp nghiên cứu .41
2.3.1. Nhóm phương pháp hoá sinh .41
2.3.2. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của một số giống ngô địa phương .45
2.3.3. Nhóm phương pháp sinh học phân tử .47
2.3.3.1. Phương pháp tách RNA tổng số theo kit Trizol (Invitrogen) 47
2.3.3.2. Phương pháp RT- PCR .47
2.3.3.3. Tạo vector tái tổ hơp . 49
2.3.3.4. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5 .49
2.3.3.5. Kiểm tra sản phẩm chọn dòng .49
2.3.3.6. Tách plasmid 49
2.3.3.7. Xác định trình tự gen .51
2.3.3.8. Phương pháp real- time PCR .51
2.3.4. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 53

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54
3.1. Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phương 54
3.1.1. Khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phương giai đoạn hạt nảy mầm 54
3.1.1.1. Ảnh hưởng của hạn đến hàm lượng đường và hoạt độ - amylase .54
3.1.1.2. Ảnh hưởng của hạn đến sự biến đổi hoạt độ protease .57
3.1.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô giai đoạn cây non 3 lá .58
3.1.2.1. Tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô khi bị hạn .58
3.1.2.2. Chỉ số chịu hạn tương đối của kiểu gen 10 giống ngô trong điều kiện hạn nhân tạo .61
3.1.3. Phân nhóm 10 giống ngô nếp nghiên cứu theo mức độ chịu hạn .63
3.2. Ảnh hưởng của hạn nhân tạo đến lượng anthocyanin ở cây ngô nếp địa phương 65
3.2.1. Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong rễ của 10 giống ngô qua các ngưỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 65
3.2.2. Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong lá của 10 giống ngô qua các ngưỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 67
3.2.3. Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá của 10 giống ngô qua các ngưỡng xử lý bởi hạn nhân tạo .70
3.2.4. Sự biến đổi hàm lượng anthocyanin trong thân và bẹ lá cây ngô qua các ngưỡng xử lý bởi hạn nhân tạo so với đối chứng 73
3.3. Phân tích trình tự đoạn gen B, Lc ở giống NH và BS1 .78
3.3.1. Đặc điểm trình tự đoạn gen B của giống NH và BS1 .78
3.3.2. Đặc điểm trình tự đoạn gen Lc của giống NH và BS1 85
3.3.3. Đặc điểm cấu trúc protein thuộc họ bHLH ở cây ngô .91
3.4. Định lượng mức độ biểu hiện của gen B và Lc bằng phản ứng real- time PCR .93
3.4.1. Định lượng mức độ biểu hiện của gen B giai đoạn cây con .93
3.4.2. Định lượng mức độ biểu hiện của gen Lc giai đoạn cây con 97

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 103
Kết luận .103
Đề nghị 103
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN LUẬN ÁN .104
TÀI LIỆU THAM KHẢO 105
PHỤ LỤC 1 127
PHỤ LỤC 2 128
PHỤ LỤC 3 131
PHỤ LỤC 4 132
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất, cung cấp lương thực cho loài người và là thức ăn cho gia súc (với 70% chất tinh trong khẩu phần ăn), là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất và chế biến lương thực- thực phẩm- dược phẩm, là mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị. Giá trị sử dụng rộng rãi của ngô được chứng minh bằng 670 mặt hàng khác nhau. Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa của nông dân vùng trung du và miền núi phía Bắc, và là cây lương thực chính của đồng bào các dân tộc thiểu số ở các vùng núi cao. Năm 2012, tỉnh Sơn La có diện tích trồng lúa là 48200 ha, ngô là 133700 ha; tỉnh Hà Giang có diện diện tích trồng lúa là 37400 ha, ngô là 52500 ha; tỉnh Cao Bằng có diện tích trồng lúa là 30700 ha, ngô là 39300 ha; tỉnh Lào Cai có diện tích trồng lúa là 30600 ha, ngô là 33700 ha [22]. Nước ta có 75% diện tích là đồi núi, lượng mưa hàng năm không đồng đều giữa các vùng, tình trạng hạn hán thường xuyên xảy ra dẫn đến năng suất của các giống cây trồng nói chung, cây ngô nếp địa phương nói riêng bị giảm. Trong những năm gần đây, hướng sản xuất ngô ở nước ta là tăng cường diện tích ngô lai có năng suất cao trên cơ sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên tiến. Các giống ngô nếp địa phương có chất lượng hạt cao, khả năng chịu hạn tốt và phù hợp với điều kiện canh tác đất dốc của từng vùng ở miền núi, nhưng do năng suất thấp nên nhiều giống quý bị mất dần. Vì vậy, việc nghiên cứu và chọn tạo các giống ngô có khả năng chịu hạn là rất cần thiết, góp phần bảo tồn nguồn gen và tạo vật liệu cho lai giống. Trước đây, công tác chọn giống truyền thống thường tốn rất nhiều thời gian và công sức, nhất là đối với những tính trạng đa gen chịu nhiều ảnh hưởng của điều kiện môi trường. Hiện nay, công nghệ sinh học được coi là phương tiện hữu hiệu để khắc phục những vấn đề khó khăn đó. Sự hiểu biết về phân tử DNA, RNA, protein, hay các hợp chất thứ cấp . có liên quan đến các đặc tính, tính trạng giúp cho người nghiên cứu chủ động lựa chọn kỹ thuật sinh học tác động vào chúng nhằm nhận dạng giống cây trồng theo mong muốn. Chọn giống nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng (Molecular Assisted Selection- MAS) đang ngày càng được quan tâm vì phương pháp này có thể rút ngắn được thời gian chọn lọc, thậm chí có thể chọn lọc sớm ở giai đoạn cây non. Anthocyanin là một loại sắc tố dịch bào, là sản phẩm thứ cấp của quá trình trao đổi chất. Anthocyanin thuộc nhóm flavonoid, xuất hiện trong các bộ phận của thực vật với màu đỏ, đỏ tía, tím và xanh đậm. Ngoài việc tạo màu sắc đẹp để bảo vệ và thụ phấn, anthocyanin còn có hoạt tính sinh học rất quý là khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp tế bào giữ nước khi mất cân bằng áp suất thẩm thấu. Anthocyanin được coi là một dấu hiệu của điều kiện cực đoan và là một phần trong cơ chế hạn chế tác động tiêu cực đó. Hiện nay, định hướng nghiên cứu xác định chỉ thị cho đặc tính chịu hạn của cây trồng đang được quan tâm, trong đó có chỉ thị sắc tố anthocyanin. Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương”.
2. Mục tiêu của đề tài
Xác định được mối tương quan giữa anthocyanin và khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phương. Xác định và phân lập được một số gen điều hòa (gen TF) quan trọng liên quan đến sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp địa phương. Đánh giá được mức độ phiên mã của gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin của ngô nếp địa phương trong điều kiện hạn.
Những mục tiêu trên nhằm định hướng ứng dụng trong tuyển chọn và bảo tồn giống ngô nếp có chất lượng và khả năng chịu hạn cao.
3. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu giai đoạn hạt nảy mầm và cây con thông qua một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh (hàm lượng đường, hoạt độ amylase, chỉ số chịu hạn tương đối .). Phân nhóm các giống ngô theo mức độ chịu hạn.
- Xác định mối tương quan giữa sự biến đổi hàm lượng anthocyanin và khả năng chịu hạn của ngô nếp địa phương ở giai đoạn cây con.
- Phân lập đoạn gen B và Lc điều hòa hoạt động của nhóm gen cấu trúc mã hoá enzyme chuyển hóa tổng hợp sắc tố anthocyanin ở đại diện thuộc nhóm chịu hạn tốt và kém trong điều kiện hạn.
- Sử dụng kỹ thuật real- time RT- PCR để phân tích, so sánh mức độ biểu hiện của gen B và Lc ở giai đoạn phiên mã của đại diện thuộc nhóm chịu hạn tốt và kém trong điều kiện hạn.