Thạc Sĩ Nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân tử và sinh học của sán lá gan lớn Fasciola SPP. ở Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Lời cảm ơn
Để hoàn thành được công trình nghiên cứu này, tôi đã nhận được rất
nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân, tổ chức. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đối tới
ban lãnh đạo Viện sốt rét – ký sinh trùng và côn trùng ương, Khoa sinh học
phân tử thuộc viện Sốt rét, phòng Ký sinh trùng, phòng Sau đại học cùng với
ban lãnh đạo viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện cho tôi
trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Ngọc Doanh,
người thầy luôn theo sát, tận tình chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tôi trong
quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện luận văn này!
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em thuộc khoa Sinh học phân tử
- Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng trung ương và phòng Ký sinh trùng
viện Sinh thái và tài nguyên Sinh vật đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện
đề tài cũng như đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn của tôi.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy/cô trong Hội đồng chấm luận văn
đã có những ý kiến đóng góp quý báu để luận văn của tôi được hoàn thiện.
Tôi xin chân thành cảm ơn, người thân, bạn bè đồng nghiệp đã ủng hộ
tôi và giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn đến 2 bên Cha, Mẹ
đã vất vả sinh thành, nuôi dưỡng cũng như tạo điều kiện để tôi có được kết
quả như ngày hôm nay. Cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến chồng và
con tôi! Những người luôn sát cánh bên tôi và luôn là chỗ dựa tinh thần để
tôi có thể hoàn thành tốt nhất luận văn này.
Hà Nội, tháng 12 Năm 2014


Nguyễn Thị Thu Huyền
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là do chính tôi thực hiện.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn trung thực và chưa từng công
bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác.Tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm về tính trung thực và khoa học của các kết quả trong nghiên cứu này.

Hà Nội, tháng 12 năm 2014
Tác giả


Nguyễn Thị Thu Huyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Mục Lục
Lời cảm ơn
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Khái quát chung về đặc điểm hình thái và vòng đời phát triển của sán lá
gan lớn Fasciola spp. 4
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn . 4
1.2. Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn . 5
1.2. Tình hình nghiên cứu về sán lá gan lớn trên thế giới . 6
1.2.1. Phân loại và phân bố của 2 loài sán lá gan lớn . 6
1.2.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở động vật và người . 7
1.2.3. Vật chủ trung gian của sán lá gan lớn 9
1.3 Tình hình nghiên cứu sán lá gan lớn tại Việt Nam. 11
1.3.1. Mầm bệnh 11
1.3.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bò. 12
1.3.3. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn trên người tại Việt Nam . 12
1.3.4. Tình hình nghiên cứu về vật chủ trung gian của sán lá gan lớn 13
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG,ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNGVÀPHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU . 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu: Sán lá gan lớn Fasciola spp. ở Việt Nam. 15
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 15
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu . 15
2.2.2. Thời gian nghiên cứu 15
2.3. Nội dung nghiên cứu 15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2.4. Phương pháp nghiên cứu 15
2.4.1. Phương pháp thu sán lá gan lớn trưởng thành từ bò: 15
2.4.2. Phương pháp thu trứng sán từ bò . 16
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hính thái sán lá gan lớn . 16
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu phân tử . 16
2.4.5. Phương pháp nuôi trứng sán lá gan lớn . 17
2.4.6. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của miracidium: 17
2.4.7. Phương pháp gây nhiễm miracidium cho ốc 17
2.4.8. Phương pháp nghiên cứu sự hóa nang và sức sống của metacercaria 18
2.4.9. Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và SPPS. 18
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19
3.1. Đặc điểm phân loại của sán lá gan Fasciola spp. ở Việt Nam 19
3.1. 1. Đặc điểm hình thái sán lá gan Fasciola spp. ở Việt Nam 19
3.1.2. Đặc điểm phân tử và quan hệ tiến hóa phân tử của sán lá gan lớn dựa
trên trình tự ITS1-5.8S rDNA-ITS2 21
3.1.3. Thảo luận . 26
3.2. Đặc điểm sinh học của sán lá gan F. gigantica 30
3.2.1. Sự phát triển của trứng sán lá gan F. gigantica . 30
3.2.2. Đặc điểm sinh học của miracidium . 34
KẾT LUẬN 51
KIẾN NGHỊ . 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO 52






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình thể sán lá gan lớn trưởng thành 4
Hình 1.2. Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn. 6
Hình 3.1. Hình thái chung của sán lá gan có ruột và tinh hoàn phân nhánh . 19
Hình 3.2. Các dạng hình thái của sán lá gan lớn thu từ bò . 20
Hình 3.3. Trình tự của TN3-Tây Ninh thể hiện một số vị trí có 2 đỉnh 24
Hình 3.4. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các loài Fasciola spp. . 25
Hình 3.5. Trứng sán lá gan trong nước cất (a) và dung dịch muối 0,85% (b) 31
Hình 3.6. Sự phát triển của trứng sán lá gan ở nhiệt độ 25-34
0
C . 32
Hình 3.7. Miracidium của sán lá gan F. gigantica 32
Hình 3.8. Ba loài ốc Lymnaea ở Việt Nam . 39
Hình 3.9. Các giai đoạn phát triển của ấu trùng sán lá gan 44
Hình 3.10. Metacercaria sống (a) và chết ở nước muối 1,5% sau 15 phút (b) . 48
Hình 3.11. Ảnh hưởng của các nồng độ muối 3 và 5% lên rau dấp cá, rau diếp
và rau ngổ sau thời gian ngâm 15 phút . 49
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nước muối 2% đến các loại rau sau khi ngâm 15
phút 50
Hình 3.13. Một muỗng canh muối 20 gram pha trong 1 lít nước để rửa rau
sống . 50







Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Vật chủ trung gian của F. hepatica ở các nước và vùng địa lý 10
Bảng 3.1. Kích thước sán lá gan lớn thu từ các địa điểm nghiện cứu 20
Bảng 3.2. So sánh kích thước của các nhóm sán lá gan có hình dạngcơ thể
khác nhau . 21
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái và phân tử của các mẫu nghiên cứu 22
Bảng 3.4. So sánh trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của 2 loài sán lá gan 23
Bảng 3.5. Sự phát triển của trứng sán lá gan ở các điều kiện khác nhau 31
Bảng 3.6. Sự phát triển của trứng sán ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau 33
Bảng 3.7. Thời điểm trứng sán nở trong ngày 35
Bảng 3.8. Khả năng sống của miracidium ở điều kiện 26-28
0
C . 36
Bảng 3.9. Độ sâu ưa thích của miracidium . 38
Bảng 3.10. Kết quả gây nhiễm miracidium sán lá gan cho các loài ốc 40
Bảng 3.11. Thời gian cercaria thoát khỏi ốc và hóa nang . 45
Bảng 3.12. Sức sống của nang sán trong các nồng độ muối khác nhau . 48




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Axit deoxyribonucleic
BL : Body length (chiều dài cơ thể)
PBS : Phosphate-buffered Saline
BW : Body width (chiều rộng cơ thể)
CO1 : Cytochrome c oxidase subunit 1
CS : Cộng sự
CT : Côn trùng
CW : Cone width (chiều rộng đầu sán)
ITS : Internal Transcribed Spacer (đoạn giao gen)
KST : Ký sinh trùng
NaCl : Natri clorua
NAD1 : Nicotinamide dehydrogenase subunit 1
PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi Polymerase)
SR : Sốt rét
WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)




1

MỞ ĐẦU
1. Sự cần thiết của đề tài
Bệnh sán lá gan lớn gây nên bởi các loài sán lá Fasciola spp., phổ biến
là 2 loài Fasciola hepatica Linnaeus, 1758và Fasciola giganticaCobbold,
1855, có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe gia súc và gây thiệt hại cho
ngành chăn nuôi.Hơn thế nữa, sán lá gan còn gây bệnh cho người.Theo tổ
chức Y tế thế giới (WHO) bệnh sán lá gan lớn là một trong những vấn đề y tế
quan trọng và luôn được quan tâm nghiên cứu. Người và động vật nhiễm
bệnh sán lá gan lớn do ăn phải rau, cỏ hoặc uống nước lã có chứa ấu trùng
cảm nhiễm metacercaria. Sán trưởng thành ký sinh ở gan vật chủ, gây tổn
thương chủ yếu ở gan, nhưng cũng có thể gây tổn thương ngoài gan khi ký
sinh lạc chỗ (Dalton 1999).
Trong vòng đời phát triển của sán lá gan lớn, trứng được thải ở gan vật
chủ, theo ống dẫn mật xuống ruột và ra môi trường cùng với phân. Gặp điều
kiện thuận lợi, trứng phát triển và nở ra thành ấu trùng
miracidium.Miracidium bơi trong nước, tìm vật chủ trung gian thích hợp để
xâm nhập và phát triển thành các giai đoạn ấu trùng sporocyst, redia và
cercaria.Cercaria trưởng thành thoát khỏi ốc, rụng đuôi hoá nang bám vào
thực vật thuỷ sinh hoặc trôi nổi trong nước. Khi vật chủ chính ăn phải thực
vật thuỷ sinh hoặc uống nước có chứa metacercaria của sán lá gan lớn thì
chúng phát triển thành con trưởng thành ký sinh ở gan. Vật chủ trung gian
thích hợp của sán lá gan lớn là ốc nước ngọt, thường là ốc thuộc họ
Lymnaeidae.Tuy nhiên, ốc vật chủ trung gian của các loài sán lá gan lớn,
thậm chí của cùng một loài ở các vùng địa lý khác nhau có thể là những loài
ốc khác nhau (Dalton 1999).Vì vậy, việc xác định chính xác vật chủ trung
gian của sán lá gan lớn rất quan trọng trong việc phòng chống bệnh sán lá gan
lớn cho gia súc và người.
2

Ở Việt Nam, số ca bệnh mắc sán lá gan lớn ở người trong những năm
gần đây tăng đáng kể, đặc biệt là ở miền Trung và miền Nam (Trần Vinh
Hiển và CS. 2006; Triệu Nguyên Trung và CS. 2012).Vì vậy, sán lá gan lớn
và bệnh sán lá gan lớn ở nước ta được đặc biệt quan tâm nghiên cứu.Tuy
nhiên, nhiều vấn đề về định loại hình thái, phân tử và vật chủ trung gian chưa
thống nhất. Các thông báo trước đây cho rằng ở Việt Nam tồn tại cả 2 loài sán
lá gan lớn, trong khi những nghiên cứu về phân tử gần đây chỉ phát hiện một
loài F. gigatica và dạng lai (Lê Thanh Hòa và cs. 2002; Nguyễn Văn Đề
2003; Lê Quang Hưng và cs. 2003; Đặng Tất Thế và cs. 2003; Nguyễn Văn
Khá 2005; Trần Vinh Hiển và cs. 2006; Nguyễn Văn Đề và cs. 2006; Le et al.
2007; Periago et al. 2006; Nguyen et al. 2009; Nguyen et al. 2012). Một số
nghiên cứu cho thấy 2 loài ốc Lymnaea viridis và Lymnaea swinhoei là vật
chủ trung gian của sán lá gan lớn (Phan Địch Lân 1985; Nguyễn Trọng Kim
1997; Nguyễn Trọng Kim và cs. 1997; Lê Hữu Khương và cs. 2001; Vũ Sĩ
Nhàn và cs. 1989; Hồ Thị Nhuận và Nguyễn Ngọc Phương 1987), trong khi
một số tác giả khác chỉ tìm thấy ấu trùng sán lá gan lớn ở ốc L. viridis (Phạm
Ngọc Doanh và Nguyễn Thị Lê 2005;Phạm Ngọc Doanh và cs. 2012; Dung et
al. 2013). Để làm sáng tỏ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài
“Nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân tử và sinh học của sán lá gan lớn
Fasciola spp. ở Việt Nam”.
2. Mục tiêu của đề tài: Làm sáng tỏ đặc điểm phân loại và sinh học của sán
lá gan lớn Fasciola spp. ở Việt Nam.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
- Cung cấp dẫn liệu chính xác về phân loại và đặc điểm sinh học của sán lá
gan lớn ở Việt Nam.
- Tạo cơ sở khoa học cho công tác phòng chống sán lá gan lớn một cách hiệu
quả, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
4. Những điểm mới của luận văn
3

- Xác định chính xác sán lá gan lớn ở Việt Nam là loài F. gigantica và có
các cá thể lai hoặc chuyển gen giữa 2 loài F. gigantica và F. hepatica.
- Xác định khả năng sống của trứng sán lá gan trong các dung dịch nồng độ
muối khác nhau, điều kiện nhiệt độ khác nhau.
- Xác định thời điểm nở trong ngày, đặc điểm bơi, độ sâu ưa thích và thời
gian sống của miracidium.
- Khẳng định chỉ có loài ốc A. viridis bị nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn F.
gigantica(= L. viridis) ở Việt Nam, còn loài R. auricularia (= L. swinhoei)
không bị nhiễm.
- Xác định ảnh hưởng của nồng độ muối đến sức sống của metacercaria, đưa
ra nồng độ muối thích hợp nhất để rửa sau sống an toàn là 2% ngâm trong 15
phút.