Thạc Sĩ Nghiên cứu đặc điểm gen mã hóa Peroxidase ở cây dừa cạn (Catharanthus Roseus (L.) G. Don)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/

iii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN . ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT . vi
MỞ ĐẦU . 1
1. ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1.ĐẶC ĐIỂM CHUNG VÀ MỘT SỐ CÔNG DỤNG CỦA CÂY DỪA CẠN . 3
1.1.1. Đặc điểm chung của cây dừa cạn 3
1.1.2. Một số công dụng của cây dừa cạn 4
1.2. HỢP CHẤT ALKALOID . 5
1.2.1. Alkaloid ở thực vật 5
1.2.2. Alkaloid ở cây dừa cạn 9
1.2.3. Một số gen liên quan đến quá trình tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn15
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ . 21
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 21
2.1.2. Hóa chất và thiết bị 21
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.2.1. Phương pháp thu mẫu 21
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử . 22
2.3. THỜI GIAN VÀ ĐI ̣A ĐIỂM NGHIÊN CỨU 26
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/

iv
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
3.1. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI VÀ TÁCH DÒNG Prx TỪ MẪU DỪA
CẠN HOA HỒNG TÍM VÀ HOA TRẮNG . 27
3.1.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen Prx từ mRNA . 27
3.1.2. Kết quả tách dòng đoạn gen Prx 28
3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG CỦA TRÌNH TỰ ĐOẠN
GEN VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN TỪ ĐOẠN GEN Prx
CỦA HAI MẪU DỪA CẠN NGHIÊN CỨU . 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/

iv
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen Prx 23
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng gắn gen Prx vào vector tách dòng pBT 24
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng colony - PCR 25
Bảng 3.1. Các vị trí nucleotide sai khác giữa ba trình tự nucleotide của
đoạn gen Prx (cDNA) . 31
Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid suy diễn của protein
Prx ở 2 mẫu dừa cạn TN 1-Hongtim, TN2-Trang và protein suy diễn từ
AY924306 trên Ngân hàng gen 33
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự nucleotide của
đoạn gen Prx ở 2 mẫu dừa cạn TN1-Hongtim, TN2-Trang và 6 mẫu dừa
cạn trên Ngân hàng gen . 34
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid của
protein Prx ở 2 mẫu dừa cạn TN1-Hongtim và TN2-Trang và 6 mẫu dừa
cạn trên Ngân hàng gen . 36









Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/

v
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus . 4
Hình 1.2. Con đường tổng hợp vinblastine và vincristine . 11
Hình 1.3. Cấu trúc intron và exon của CrPrx . 16
Hình 3.1. Kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoa ̣n cDNA CrPrx 27
Hình 3.2. Kết quả điê ̣n di sản phẩm colony - PCR từ khuẩn lạc 28
Hình 3.3. So sánh trình tự đoạn gen Prx của mẫu dừa cạn TN1-Hongtim,
TN2-Trang và AY924306 . 30
Hình 3.4. So sánh trình tự amino acid suy diễn của hai mẫu dừa cạn TN 1-
Hongtim, TN2-Trang và của protein suy diễn từ AY924306 trên Ngân hàng gen . 32
Hình 3.5. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng đoạn gen Prx của 8
mẫu dừa cạn . 35
Hình 3.6. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng dựa trên trình tự
amino acid suy diễn của 8 mẫu dừa cạn 36









Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/

vi
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
CrPrx Catharanthus roseus peroxidase Gen Prx ở cây dừa cạn
DAT Deacetylvindoline 4-O-acetyl tranferase Gen DAT ở cây dừa cạn
DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic
FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm
và Dược phẩm Hoa Kỳ
ORCAs Octadecanoid - responsive Catharanthus Các gen ORCA
AP2/ERF domain
ORF Open read frame Khung đọc mở
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp
Prx Peroxidase Gen mã hóa peroxidase
Prx Peroxidase Protein peroxidase
RNA Ribonucleic acid Axit Ribonucleic
TIAs Terpenoid indole alkaloids


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/

1
MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự thay đổi khí hậu toàn cầu dẫn tới sự khắc nghiệt của thời tiết, môi
trường sống bị ô nhiễm, thói quen sinh hoạt của con người thay đổi Những
yếu tố này tác động đến sức khỏe của con người, làm gia tăng nguy cơ mắc
bệnh, trong đó có nguy cơ các tế bào bị biến đổi. Đây là một trong các nguyên
nhân làm cho số ca mắc bệnh ung thư ngày càng tăng. Trong khi đó, các loại
thuốc chữa trị ung thư chưa nhiều và giá thành của chúng khá đắt. Vì thế, một
trong những nhiệm vụ hàng đầu của các nhà khoa học là nghiên cứu, cải tiến
các biện pháp chữa trị ung thư để kéo dài thời gian sống cho người bệnh. Xu
hướng của thế giới hiện nay là nghiên cứu phương pháp làm tăng hàm lượng
alkaloid ở cây thảo dược để hạ giá thành thuốc chữa bê ̣nh.
Dừa cạn là một trong những cây có khả năng sản xuất các indol
alkaloid có dược tính quan trọng trong chế tạo các loại thuốc chống ung thư.
Đặc biệt là hai loại vinblastine, vincristine có tác dụng chữa ung thư máu.
Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong tế bào thực vật (khoảng
nửa tấn lá khô dừa cạn mới chiết được 1g vinblastine cho sản xuất dược
phẩm, còn vincristine thì ít hơn 10 lần nữa [6]) và không thể tổng hợp bằng
con đường hóa học do chúng có cấu trúc rất phức tạp. Do vậy, nâng cao hàm
lượng vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn theo hướng công nghệ gen
là một hướng nghiên cứu được quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới.
Để triển khai theo hướng nghiên cứu này, nhiều gen liên quan đến con đường
sinh tổng hợp alkaloid trong dừa cạn đã được phân lập và nghiên cứu.
Trong cây dừa cạn, vinblastine và vincristine được tạo ra từ sự kết hợp
các tiền chất như catharanthine và vindoline dưới sự điều khiển của một số
gen như DAT, ORCA3, Prx Trong đó, peroxidase (Prx) là một enzyme quan
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/

2
trọng xúc tác ở giai đoạn cuối của quá trình tổng hợp vinblastine và
vincristine.
Nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa
cạn để phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư là rất cần thiết. Để tăng
năng suất tổng hợp hai loại ankaloid trên, việc nghiên cứu đặc điểm gen mã
hóa enzyme xúc tác là rất quan trọng. Tuy nhiên, hiện nay trên thế giới và
Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về các gen này. Vì vậy, chúng
tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm gen mã hóa
peroxidase ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Xác định được trình tự đoạn gen mã hóa enzyme Prx ở cây dừa cạn
(Catharanthus roseus (L.) G. Don) mẫu hoa hồng tím, hoa trắng và so sánh
với một số trình tự đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế.
So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein Prx hai mẫu hoa hồng
tím, hoa trắng với một số trình tự amino acid đã công bố trên Ngân hàng gen
quốc tế.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Khuếch đại tách dòng và xác định trình tự đoạn gen Prx của hai mẫu dừa
cạn hoa hồng tím và hoa trắng.
- So sánh trình tự đoạn gen Prx, trình tự amino acid suy diễn của protein
Prx các mẫu dừa cạn nghiên cứu với một số trình tự đã công bố trên Ngân
hàng gen.