Tiến Sĩ Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh.

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2015
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU . 1
1.1 Tính cấp thiết của đề tài . 1
1.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu . 3
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 3
1.2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu . 3
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu . 3
1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 4
1.5 Những đóng góp của luận án . 4
1.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án 4
CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 5
2.1 Lịch sử bệnh do vi khuẩn tả . 5
2.2 Tổng quan về Vibrio 6
2.2.1 Đặc điểm các loài thuộc giống Vibrio . 7
2.2.2 Phân loại vi khuẩn V. cholerae . 9
2.2.3 Đặc điểm hình dạng của V. cholerae . 11
2.2.4 Đặc điểm sinh thái của V. cholerae . 11
2.2.5 Sức đề kháng của V. cholerae 15
2.3 Tình hình dịch tễ học của bệnh tả do V. cholerae 15
2.3.1 Tình hình dịch tễ do V. cholerae ở các nước trên thế giới . 15
2.3.2 Tình hình dịch tễ do V. cholerae ở Việt Nam . 20
2.3.3 Nguồn truyền nhiễm và các phương thức truyền lây của V.
cholerae .
2.4 Đặc điểm di truyền của V. cholerae 25
2.4.1 Độc lực của V. cholerae 26
2.4.2 Đặc tính di truyền về độc lực của V. cholerae . 27
2.4.3 Các yếu tố về độc lực 29
2.5 Cơ chế gây bệnh của V. cholerae 31
2.6 Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn . 33
2.6.1 Khái niệm 33
2.6.2 Cơ chế kháng kháng sinh 33
2.6.3 Sự kháng kháng sinh do V. cholerae ở các nước trên thế giới 35
2.6.4 Sự kháng kháng sinh của V. cholerae ở Việt Nam 37
2.6.5 Cơ chế kháng kháng sinh của V. cholerae . 39
2.6.6 Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn đối với tetracycline . 41
2.7 Tính miễn dịch đối với vaccine phòng bệnh tả trên người . 45
2.7.1 Nguyên lý sử dụng vaccine 45
2.7.2 Cơ chế hoạt động của vaccine . 46
CHƯƠNG III: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 47
3.1 Nội dung nghiên cứu 47
3.2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 47
3.2.1 Phương tiện nghiên cứu 47
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu . 49
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 66
4.1 Kết quả phân lập và định danh Vibrio spp. 66
4.1.1 Kết quả phân lập Vibrio spp 66
4.1.2 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng phản ứng sinh hóa . 67
4.1.3 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng máy định danh tự động . 69
4.1.4 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR 70
4.1.5. Tỉ lệ phát hiện Vibrio spp. trên các loại mẫu phân lập 71
4.1.6 Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên nghêu ở huyện Cầu Ngang và
Duyên Hải .74
4.1.7 Tỉ lệ nhiễm Vibrio spp. trên huyết heo tại một số huyện . 75
4.2 Kết quả định type huyết thanh học . 76
4.3 Kết quả tính tương đồng giữa các loài thuộc Vibrio trên
Genbank bằng công cụ BLAST .77
4.4 Sự kháng kháng sinh của V. cholerae 84
4.4.1 Kết quả khảo sát sự kháng kháng sinh của V. cholerae bằng
phương pháp Kirby Bauer (CLSI, 2010) 84
4.4.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) . 87
4.4.3 Sự hiện diện một số gene kháng kháng sinh ở vi khuẩn phân
lập 89
4.4.4 Kết quả giải trình tự các đoạn gen kháng kháng sinh 90
4.4.5 So sánh trình tự nucleotid của chủng V. cholerae T1, T3 với
chủng V. cholerae hoang dại N16961 92
4.4.6Quan hệ di truyền của các chủng V. cholerae dựa vào gene
kháng kháng sinh tetA 96
4.5 Thử nghiệm độc lực chủng V. cholerae và đánh giá đáp ứng
miễn dịch trên thỏ . 100
4.5.1 Kết quả đánh giá chủng V. cholerae không uống vaccine
phòng bệnh tả . 100
4.5.2 Kết quả đánh giá tính đáp ứng miễn dịch trên thỏ đã uống
vaccine phòng bệnh tả 103
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 107
5.1 Kết luận . 107
5.2 Đề nghị 107
Danh mục các công trình đã công bố có liên quan đến luận án 108


TÀI LIỆU THAM KHẢO
109 -123
PHỤ LỤC
1a Sắc phổ chuỗi trình tự chủng Ng3 (F11) .124-125
1b NCBI Blast V.cholerae (F11) 126-130
2a Sắc phổ chuỗi trình tự chủng N8 (F17) .131
2b NCBI Blast V.cholerae N8 (F17) 132-136
3 NCBI Blast V.cholerae O3.2 (F13) 137-141
4 NCBI Blast V.cholerae O1.2 (F14) 142-146
5a Sắc phổ chuỗi trình tự 16S rRNA chủng O9.1 (F15) 147
5b NCBI Blast V.paraheamolyticus O9.1 (F15) 148-152
6a Sắc phổ chuỗi trình tự gen kháng KS TetA chủng T1 .153
6b NCBI Blast gene kháng kháng sinh T1 .154-157
7 NCBI Blast gene kháng kháng sinh T3 .158-159
8 Sự tương đồng về trình tự Nucleotide của các chủng V.
cholerae phân lập và các chủng V. cholerae trên Genbank .
9 Tổng hợp kết quả thử kháng sinh đồ đối với V. cholerae 162
10 Chủng V. cholerae kháng thuốc chủ yếu từ năm 2003 – 2009 ở
một số nước trên thế giới
11 Các acid amin trình tự chủng T1 .166
12 Các acid amin trình tự chủng T3 167
13 Các acid amin chủng hoang dại N16961 168
14 Kết quả xử lý thống kê .169-174
15 Thành phần môi trường, hoá chất dùng trong thí nghiệm .175-178
16 Hệ thống định danh trực khuẩn Gram âm (IDS 14 GNR) 179
17 Vaccine tả dùng trong thí nghiệm .179
18 Kết quả các phản ứng sinh hoá .
25 chủng
Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Vibrio cholerae là vi khuẩn Gram âm, tác nhân của bệnh dịch tả trên
người, gây tiêu chảy cấp tính và mất nước, dịch bệnh xảy ra với các hình thức
dịch địa phương và đại dịch. Thế giới đã trải qua 7 đại dịch dịch tả, từ năm 1816
đến năm 1923 đã có 6 vụ đại dịch xảy ra, những đại dịch này đều bắt đầu từ Ấn
Ðộ và đều do V. cholerae O1 type sinh học cổ điển gây ra. Đại dịch thứ 7 khác
với 6 đại dịch trước, đại dịch này do V. cholerae type sinh học El Tor gây ra và
có nguồn gốc từ đảo Celebes của Indonesia năm 1961. Đại dịch này kéo dài nhất
và có phạm vi rộng hơn 6 đại dịch trước đó, đến nay còn nhiều nước thông báo
những đợt bùng phát dịch tả cũng do nguyên nhân này gây ra (Hayes, 2005).
Ở Việt Nam, bệnh tả là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra
tiêu chảy hơn một thế kỷ nay, với 2.000.000 trường hợp được báo cáo trong năm
1850. Năm 1885, một đợt bùng phát dịch tả với tỉ lệ tử vong lên đến 50% và đến
năm 1910-1930 có 5.000 đến 30.000 trường hợp bệnh tả đã được báo cáo hàng
năm (Nguyen, 1962).
Trong những năm gần đây, Việt Nam đã xảy ra 3 đợt dịch tiêu chảy cấp
nguy hiểm ở 18 tỉnh, thành thuộc cả 3 miền Bắc, Trung, Nam. Năm 2009 - 2010,
dịch tả lại xuất hiện tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam (Nguyen et al., 2012).
Đồng bằng sông Cửu Long, tính đến 19/8/2010 đã có 4 địa phương
gồm: Bến Tre, Tiền Giang, thành phố Cần Thơ và An Giang xuất hiện bệnh
nhân mắc bệnh tiêu chảy do vi khuẩn V. cholerae (Nguyễn Hoàng Vũ, 2011).
Tỉnh Trà Vinh có vị trí địa lý với nhiều nguy cơ tiềm ẩn bệnh dịch tả vì có bờ
biển kéo dài khoảng 65 km và trên địa bàn Trà Vinh có hệ thống sông chính
với tổng chiều dài 578 km, trong đó có các sông lớn là sông Hậu, sông Cổ



Chiên và sông Măng Thít, vì thế rất dễ cho việc lưu hành vi khuẩn tả từ sông
Cổ Chiên giáp với tỉnh Bến Tre, nơi đã từng xảy ra dịch bệnh vào năm 2010.
Biển Duyên Hải và Cầu Ngang thuộc tỉnh Trà Vinh là vùng chuyên nuôi
trồng thủy sản, trong đó phổ biến nhất là nghêu và tôm. Đã có nhiều nghiên
cứu chứng minh thức ăn hải sản là nguồn lưu trữ vi khuẩn gây bệnh tả được
xác định là V. cholerae. Vi khuẩn này có cấu trúc gene của chủng thuộc type
sinh học El tor, nhưng lại mang gene độc lực của type sinh học cổ điển, khiến
nó tăng độc lực và gây bệnh với triệu chứng lâm sàng nặng hơn, người khỏe
mang trùng và thời gian mang trùng dài hơn, khả năng tồn tại lâu hơn trong môi
trường (Boyd et al., 2008). Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy triệu chứng chính của
bệnh tả trên người là do độc tố của vi khuẩn V. cholerae gây ra. Vi khuẩn có
mặt ở các môi trường nước biển và nguồn nước bị ô nhiễm (Nguyen Binh
Minh et al., 2002).
Có nhiều loại kháng sinh sử dụng điều trị bệnh tả đang đề kháng với vi
khuẩn này, trong đó có V. cholerae, đây là vấn đề phức tạp trong điều trị bệnh
và là mối quan tâm đối với sức khỏe cộng đồng. Nhiễm sắc thể được chứng
minh là yếu tố di truyền về gene kháng kháng sinh của vi khuẩn. Việc thu
nhận và lây truyền của các gene kháng kháng sinh là do các yếu tố di truyền
như plasmid, integrons và transposons (Ghosh et al., 2011). Một trong những
yếu tố di truyền được tích hợp và sao chép trên nhiễm sắc thể và được truyền
gene kháng kháng sinh giữa các vi khuẩn cùng loài trong môi trường (Burrus
et al., 2004).
Thực phẩm và nước ô nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh là một mối đe
dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng, càng quan tâm hơn nữa là kháng sinh
được bổ sung vào thức ăn cho động vật đã góp phần vào việc kháng kháng
sinh khi điều trị bệnh trên người (Smith et al, 1999). Nhiều nghiên cứu về V.
cholerae được phân lập từ các nguồn nước sông và nước biển, trên các loại
mẫu thức ăn hải sản đều cho thấy vi khuẩn này có khả năng kháng lại hầu hết
các kháng sinh thường được sử dụng, điều này có thể khẳng định trong thực tế
việc kháng kháng sinh đang gia tăng cả trong lĩnh vực chăn nuôi trang trại và
y tế công cộng, đây cũng là vấn đề toàn cầu trong những thập kỷ gần đây do
sử dụng bừa bãi và lạm dụng kháng sinh trong các trang trại chăn nuôi và thực
phẩm làm thức ăn gia súc, gia cầm (Teuber, 2001; Bywater, 2004).
Với tính chất lây lan và nguy hiểm của bệnh dịch tả, đặc biệt là vùng
đồng bằng sông Cửu Long, nghiên cứu này được thực hiện nhằm góp phần xác
định tỉ lệ nhiễm của vi khuẩn V. cholerae và mức độ kháng kháng sinh của vi
khuẩn đang gia tăng cả trong môi trường và thức ăn từ hải sản, cùng với mục
tiêu xác định mối liên quan về đặc điểm di truyền gene kháng kháng sinh của
V. cholerae phân lập được từ môi trường nước và trên các loại mẫu có nguồn
gốc từ hải sản. Nghiên cứu đã tiến hành từ năm 2012 đến 2014 với nội dung:
“Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae phân
lập tại tỉnh Trà Vinh”, từ đó giúp cơ sở y tế có chiến lược sử dụng kháng sinh
đúng nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm chi phí trong điều trị bệnh, phù hợp
với điều kiện kinh tế trong khu vực. 1.2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định tỉ lệ nhiễm và type huyết thanh học của các chủng V.
cholerae phân lập được.
- Xác định đặc tính kháng kháng sinh của các chủng V. cholerae.
- Xác định các kiểu đột biến gene gây kháng thuốc của các chủng
Vibrio cholerae và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch với V. cholerae ở thỏ đã
được chủng vaccine đang lưu hành trên thị trường.
- Định danh các chủng vi khuẩn phân lập và đánh giá quan hệ di truyền
giữa các chủng phân lập với các chủng đã công bố.