Tiến Sĩ Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (Penaeus monodon)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NĂM 2012

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN . i
LỜI CAM ĐOAN ii
MỤC LỤC . iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT . vi
DANH MỤC CÁC BẢNG . viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ix
MỞ ĐẦU . 1
1. Đặt vấn đề . 1
2. Mục tiêu nghiên cứu . 2
3. Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . . 3
1.1. Tôm sú và các bệnh thường gặp ở tôm sú . 3
1.1.1. Giới thiệu về tôm sú 3
1.1.2. Tình hình nuôi và dịch bệ nh tôm sú ở Việ t Nam 5
1.1.3. Các bệnh thường gặp ở tôm sú . 7
1.1.4. Phương phá p phòng và trị bệnh ở tôm sú . 12
1.2. Hệ miễn dịch tôm sú 14
1.2.1. Đáp ứng miễn dịch tế bào . 15
1.2.2. Đáp ứng miễn dịch dịch thể 21
1.3. Nghiên cứ u gen và tiề m năng ứ ng dụ ng trong phò ng trị bệ nh cho tôm s.u.́ . 23
1.3.1. Tình hình nghiên cứu genome tôm sú trên thế giới 23
1.3.2. Nghiên cứu gen liên quan đế n khả năng miễ n dịch ở tôm sú . 24
1.3.3. Tiề m năng ứng dụ ng củ a gen liên quan đế n miễ n dịch trong phò ng
trị bệnh ở tôm sú 28

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 32
2.1. Vật liệu 32
2.1.1. Thu thập mẫu 32
2.1.2. Hóa chất 32
2.1.3. Thiết bị 34
2.1.4. Các vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu . 34
2.2. Phương pháp nghiên cứu . 35
2.2.1. Tách chiết RNA tổng số 36
2.2.2. Tinh sạch mRNA 37
2.2.3. Tổng hợp cDNA 38
2.2.4. Thiết kế mồi phân lập một số gen (cDNA) lựa chọn 41
2.2.5. Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR 48
2.2.6. Tinh sạch sản phẩm PCR 49
2.2.7. Tạo dòng phân tử sản phẩm PCR . 49
2.2.8. Xác định trình tự gen (cDNA) . 50
2.2.9. Biểu hiện gen ALFPm3 . 50
2.2.10. Phân tích dữ liệu trình tự và xử lý số liệu . 55
2.3. Địa điểm nghiên cứu . 55

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 56
3.1. Rab7 - protein liên quan đế n cơ chế xâm nhiễ m củ a virus . 56
3.1.1. Tạo dòng gen Rab7 từ mẫu tôm sú Việt Nam 56
3.1.2. Xác định và phân tích trình tự gen Rab7 58
3.2. Syntenin - protein liên quan đến con đườ ng dẫ n truyề n tín hiệ u 61
3.2.1. Phân lậ p đoạn 5‟-syntenin từ mẫu tôm sú Việt Nam 62
3.2.2. Tạo dòng gen syntenin hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam . 64
3.2.3. Xác định và phân tích trình tự gen syntenin . 65
3.3. Hemocyanin - protein có hoạt tính phenoloxidase 68
3.3.1. Phân lập đoạn 5‟-hemocyanin từ mẫu tôm sú Việt Nam 69
3.3.2. Tạo dòng gen hemocyanin hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam . 72
3.3.3. Phân tích trình tự gen hemoccyanin 74
3.4. Ran - protein điề u khiể n thự c bà o . 76
3.4.1. Tạo dòng một phần đoạn gen Ran từ mẫu tôm sú Việt Nam . 77
3.4.2. Phân lập đoạn gen 3‟ và 5‟-Ran 78
3.4.3. Tạo dòng gen Ran hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam 82
3.4.4. Xác định và phân tích trình tự gen Ran 83
3.5. Caspase - protein tham gia và o cơ chế apoptosis 84
3.5.1. Tạo dòng gen caspase từ mẫu tôm sú Việt Nam 85
3.5.2. Xác định và phân tích trình tự gen caspase 86
3.6. Hệ thống các protein kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus 90
3.6.1. Protein khá ng virus PmAV . 90
3.6.2. Peptide khá ng khuẩ n t ương tự crustin (crustin - like antimicrobial
peptide) 94
3.6.3. Yế u tố khá ng khuẩ n (ALF - antiliposaccharide factor) 99
3.7. Biể u hiệ n yế u tố khá ng khuẩ n tái t ổ hợp (rALFPm3) . 105
3.7.1. Tạo cấu trúc vector biểu hiện gen . 105
3.7.2. Xác định cấu trúc gen ALFPm3 được chuyển vào genome nấm men 108
3.7.3. Xác định đoạn peptide ALFPm3 được biểu hiện 109
3.7.4. Phân tích hoạt tính của rALFPm3 . 111
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . . 113
1. Kết luận 113
2. Kiến nghị 114
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 115
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC .

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Tôm sú là động vật thủy sản dùng làm thực phẩm mang lại lợi nhuận lớn nhờ
xuất khẩu tại nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Những năm đầu thập
niên 90 của thế kỷ XX, cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm công nghiệp, “dịch
bệnh” ở tôm cũng bắt đầu xuất hiện và lan rộng khắp thế giới. Tác nhân gây bệnh
chính phải kể đến là vi khuẩn và virus. Hiện nay, các nghiên cứu cho thấy việc giảm
sút sản lượng tôm nuôi liên quan đến bệnh vi khuẩn thường do các vi khuẩn
thuộc chi Vibrio spp. Trong đó, loài gây bệnh phổ biến nhất là vi khuẩn phát sáng
V. harvey. Các tác nhân gây bệnh do virus bao gồm virus gây bệnh đầu vàng
(Yellow head virus - YHV), virus gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus -
WSSV) được xem là các tác nhân gây bệnh nghiêm trọng nhất và làm thiệt hại
đáng kể đến nghề nuôi tôm.
Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về sự điều khiển sinh trưởng, sinh sản và
đặc biệt là hệ thống miễn dịch ở tôm sú còn rất hạn chế do thiếu những thông tin về
genome và sự biểu hiện gen của chúng. Kích thước genome tôm sú là rất lớn (khoảng
trên 2 tỉ cặp base = 2/3 bộ gen người), nên việc giải mã toàn bộ genome tôm sú đòi
hỏi nhiều thời gian và chi phí lớn, ước tính hàng chục triệu đô la. Vì vậy, một trong
những hướng nghiên cứu đượ c lự a chọ n là lập bản đồ di truyền liên kết genome tôm
sú, lập bản đồ di truyền từ DNA vệ tinh, phân tích trình tự đầy đủ genome ty thể
(mtDNA), lập bản đồ gen tôm sú bằng giải mã EST/cDNA, nghiên cứu và phân tích
các đoạn trình tự gen biểu hiện (Express sequence tag - EST), lựa chọn các chỉ thị
phân tử phục vụ công tác chọn giống, nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các gen
liên quan.
Tôm sú không có hệ thống đáp ứng miễn dịch thích ứng thực sự (adaptive
immune system), thay vào đó chúng phát triển hệ thống bảo vệ cơ thể khác được gọi
là miễn dịch tự nhiên (innate immunity). Những nghiên cứu về phản ứng tế bào và
dịch thể ở tôm khi bị nhiễm vi khuẩn, virus đã được các nhà khoa học rất quan tâm,
đặc biệt là xác định và phân tích đặc điểm của các gen tham gia vào quá trình đáp
ứng miễn dịch. Việc phát triển và ứng dụng rộng rãi Công nghệ sinh học trong lĩnh
vực thủy sản đã đóng vai trò quan trọng trong giải thích các quá trình phát sinh
mầm bệnh, phát triển các phương thức chẩn đoán và phòng ngừa, nhằm duy trì sự
ổn định của nghề nuôi tôm, kiểm soát hậu quả dịch bệnh, hạn chế thiệt hại do dịch
bệnh ở tôm nuôi. Hiện nay, để xử lý tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, thuốc kháng
sinh và hóa chất là phương pháp chính được sử dụng. Tuy nhiên, hạn chế của
phương pháp này là chi phí mua thuốc lớn, tồn dư kháng sinh có thể đe dọa đến sức
khỏe cộng đồng, ảnh hưởng đến môi trường, đồng thời xuất hiện các mầm bệnh
kháng thuốc và chúng có thể lây nhiễm cho con người. Mặt khác, đối với các dịch
bệnh do virus khi đã xảy ra thì chưa có biện pháp nào trị bệnh. Đến nay, những đáp
ứng miễn dịch của tôm đối với nguồn bệnh virus vẫn chưa được sáng tỏ. Do đó,
việc nghiên cứu cơ chế miễn dịch của tôm ở mức độ phân tử là cần thiết để đưa ra
các giải pháp đúng đắn trong phòng trị bệnh cho tôm.
Trong những năm gần đây, ở Việt Nam đã bước đầu có các nghiên cứu nhằm
nâng cao chất lượng giống và kiểm soát dịch bệnh ở tôm. Các nghiên cứu tập trung
phát hiện bệnh tôm và đưa ra giải pháp phòng bệnh cho tôm. Ngoài ra, một vài cấu
trúc protein tái tổ hợp của WSSV đã được tạo ra trong phò ng thí nghiệ m nhằm mục
đích nghiên cứu phòng trị bệnh cho tôm. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về các
gen liên quan đến hệ miễn dịch tôm sú còn ít được biết đến. Do đó, để góp phần làm
sáng tỏ cơ chế phân tử đáp ứng miễn dịch và tạo nguyên liệu cho nghiên cứu phòng
trị bệnh ở tôm sú, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm cấu
trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (Penaeus monodon)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Phân lập và xác định được trình tự một số gen lựa chọn liên quan đến hệ
miễn dịch tôm sú, tạo vật liệu nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ cơ chế đáp ứng
miễn dịch và giải pháp trong phòng trị bệnh cho tôm sú;
- Bước đầu nghiên cứu tạo peptide kháng khuẩn rALFPm3.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập một số gen lựa chọn liên quan đến hệ miễn dịch tôm sú được tiến
hành theo 3 hướng: các gen đã có thông tin trình tự được công bố; các gen chỉ có
một phần thông tin trình tự; gen chưa có thông tin về trình tự.
- Thiết kế vector mang gen mã hóa peptide kháng khuẩn, biểu hiện trong
nấm men và bước đầu phân tích hoạt tính của peptide tái tổ hợp.