1. Đặt vấn đề MỞ ĐẦU Gà nhà (Gallus gallus domesticus) là giống vật nuôi phổ biến nhất trên thế giới. Theo Tổ chức Lương thực và nông nghiệp Thế giới (FAO), số lượng gà trên toàn cầu năm 2007 ước tính đạt khoảng 17 tỉ con, hơn một nửa trong số đó là ở châu Á. Đây là một trong những nguồn thực phẩm thiết yếu của con người, đặc biệt là ở những nước đang phát triển, cung cấp gần như toàn bộ nhu cầu về thịt và trứng cho những vùng nông thôn hẻo lánh và khoảng 20% nhu cầu cho khu vực đô thị [31]. Ngoài mục đích làm thực phẩm, gà nhà còn được nuôi làm cảnh, chọi gà hay làm thuốc. Không những thế, gà còn là đối tượng được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu y sinh [29], [59]. Trong ngành nông nghiệp nước ta, chăn nuôi gà chiếm tới 72 - 73% tổng đàn gia cầm hàng năm. Năm 2006, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã xây dựng chiến lược phát triển chăn nuôi gia cầm Việt Nam giai đoạn 2006 - 2015. Theo đó, ngành chăn nuôi phải phấn đấu đến năm 2015 tăng tỷ trọng thịt gia cầm lên 32% tổng sản lượng thịt các loại, trong đó sản lượng thịt gà chiếm 88% tổng đàn gia cầm, đạt 350 triệu con, khối lượng thịt 1.992.000 tấn, sản lượng trứng 9,236 tỷ quả [3]. Để đạt được mục tiêu trên thì cần thiết phải cải thiện nguồn con giống, đồng thời phải bảo tồn và phát triển những giống gia cầm quý của địa phương. Ở nước ta có 27 giống gà, trong đó có tới 16 giống gà nội. Các giống gà nội như gà Ri, gà Đông Tảo, gà H’Mông, gà Tre . là các giống có phẩm chất thịt trứng thơm ngon, khả năng chịu đựng kham khổ, khả năng chống chịu bệnh tật cao, là nguồn gen quý và cần được đầu tư chọn tạo để nâng cao năng suất và dùng lai tạo với các giống khác để cải tiến năng suất, tạo con lai năng suất cao cung cấp con giống cho sản xuất [2], [3], [11]. Tuy nhiên, do truyền thống chăn nuôi nhỏ lẻ theo hộ gia đình, các giống gà này thường được chăn thả tự do cùng với các giống gà nội khác ở các địa phương, cùng với sự du nhập của vật liệu di truyền mới do việc nhập khẩu một cách ồ ạt các giống nhập ngoại nên chúng đứng trước nguy cơ bị lai tạp, mất dần. Do đó, vấn đề bảo tồn nguồn gen các giống gia cầm quý là một yêu cầu bức thiết của thực tế. Nghiên cứu đa dạng di truyền các giống vật nuôi là bước đầu tiên trong quy trình tiến tới mục tiêu bảo tồn, cải tiến và sử dụng nguồn giống. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử thì việc nghiên cứu đa dạng di truyền đã được tiến hành ở cấp độ DNA - vật chất di truyền của sự sống. Cũng như các loài động vật có xương sống khác, hệ gen của gà cũng gồm hệ gen nhân và hệ gen ty thể (mtDNA). Do kích thước của hệ gen nhân là rất lớn, việc sử dụng các gen trong nhân làm đối tượng nghiên cứu đa dạng di truyền có một số nhược điểm. Gen nhân có tần số đột biến thấp, mặt khác chúng lại được di truyền từ cả bố và mẹ và bị phân ly qua mỗi thế hệ nên việc dò tìm tổ tiên và mối quan hệ di truyền của đoạn DNA nào đó trở nên rất khó khăn. Bởi vậy, DNA ty thể với những lợi thế của mình như tần số đột biến cao, di truyền theo dòng mẹ, không tái tổ hợp, số lượng bản sao lớn và khá đồng nhất đã, đang và sẽ là công cụ phân tử hữu hiệu trong các nghiên cứu về di truyền quần thể và phát sinh chủng loại [15], [30], [50], [57]. Hệ gen ty thể có hai vùng chức năng chính. Vùng mã hóa chiếm tới 93% hệ gen ty thể, vùng còn lại được gọi là vùng D-loop (vùng siêu biến hay vùng điều khiển) không được dịch mã, chứa trình tự khởi đầu cho quá trình tái bản của chuỗi nặng và các trình tự điều khiển quá trình phiên mã của các gen trong vùng mã hóa. Vùng D-loop có tốc độ tiến hóa nhanh hơn nhiều so với các vùng khác của hệ gen ty thể, vì vậy nó là vùng thích hợp và có giá trị nhất trong phân tích di truyền quần thể, đặc biệt là đối với các nghiên cứu biến đổi di truyền bên trong loài [25]. Do đó, xác định và so sánh trình tự mtDNA nhất là trình tự vùng D-loop là phương pháp có độ tin cậy cao được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền quần thể [30], [34], [36], [49]. Kể từ khi trình tự toàn bộ hệ gen ty thể gà được Desjardins và Morais (1990) công bố lần đầu tiên, việc nghiên cứu DNA ty thể gà đã và đang được phát triển tương đối rộng rãi với hàng nghìn trình tự được đăng ký trên GenBank. Trình tự hệ gen ty thể đã được sử dụng thành công trong việc xác định đa dạng di truyền của các quần thể gà trên thế giới [27], [41], [46], [52]. Những dữ liệu này đã góp phần giúp hiểu rõ hơn về quá trình thuần hóa và quan hệ di truyền của các giống gà. Ở Việt Nam, việc giải mã hệ gen ty thể nhằm tìm hiểu mối quan hệ di truyền và tiến hóa giữa các giống gà vẫn còn là vấn đề mới. Các nghiên cứu về hệ gen ty thể nói chung và vùng D-loop nói riêng còn rất ít, mang tính cá thể và không đặc trưng cho quần thể. Với mục đích góp phần vào việc giải mã hệ gen ty thể của các giống gà địa phương Việt Nam và nghiên cứu mối quan hệ di truyền và tiến hóa của các giống gà, trên cơ sở phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop), chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đa hình trình tự vùng điều khiển (D-loop) hệ gen ty thể của gà Ri, gà Đông Tảo và gà Tre”. MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU . 01 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 04 1.1. SƠ LưỢC VỀ NGUỒN GỐC VÀ VỊ TRÍ PHÂN LOẠI GÀ NHÀ . 04 1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU . 06 1.2.1. Gà Ri . 06 1.2.2. Gà Đông Tảo (Ðông Cảo) . . 07 1.2.3. Gà Tre . 08 1.3. ĐẶC ĐIỂM HỆ GEN TY THỂ VÀ VAI TRÒ CỦA D-LOOP TRONG ĐỊNH LOẠI GÀ 08 1.3.1. Ty thể và đặc điểm cấu trúc, cơ chế di truyền hệ gen ty thể gà . 08 1.3.1.1. Đặc điểm cấu trúc ty thể . 08 1.3.1.2. Cấu trúc hệ gen ty thể gà . 09 1.3.1.3. Cơ chế di truyền của mtDNA . 13 1.3.2. Cấu trúc và vai trò của vùng D-loop trong đánh giá đa dạng di truyền . . 14 1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU VỀ ĐỊNH LOẠI PHÂN TỬ DỰA TRÊN GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG D-LOOP TY THỂ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM . 16 1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới 16 1.4.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam . 20 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22 2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU . 22 2.1.1. Nguyên liệu 22 2.1.2. Thiết bị 22 2.1.3. Hoá chất . 23 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu . . 23 2.2. CÁC PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 24 2.2.1. Điện di trên gel agarose . 24 2.2.2. Khuếch đại vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) . 26 2.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR . . . . 28 2.2.4. Giải trình tự vùng D-loop . 29 2.2.5. Phân tích dữ liệu bằng phần mềm chuyên dụng. . 30 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . . 31 3.1. Nhân vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR 31 3.2. Xác định và so sánh trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu với trình tự chuẩn trên GenBank . 36 3.3. Sự đồng nhất về trình tự nucleotide của 3 giống gà . . 56 3.4. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu 56 3.5. So sánh mức độ đa dạng di truyền của 3 giống gà nghiên cứu với một số quần thể gà châu Á . 58 3.6. xây dựng cây phát sinh chủng loại . 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 NHưNG CHỮ VIÊT TĂT ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (căp bazơ) CJF Gà rừng Cyelon ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate DNase Deoxyribonuclease đtg Đồng tác giả EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid EtBr Ethidium bromide ETOH Ethanol GJF Gà rừng màu xám GrJF Gà rừng màu xanh mtDNA Hệ gen ty thể Nxb Nhà xuất bản PCR Polymerase Chain Reaction RJF Gà rừng đỏ RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease rpm Vòng/ phút TAE Tris – acetate – EDTA Tm Nhiệt độ biến tính DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Thành phần phản ứng khuếch đại DNA . 34 Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 35 Bảng 3.3. Các điểm đa hình trong vùng D -loop của 3 giống gà nghiên cứu . 51 Bảng 3.4. Sự phân bố của 71 mẫu gà nghiên cứu theo các kiểu đơn bội . . 55 Bảng 3.5. Mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu . . 58 Bảng 3.6. So sánh mức độ đa dạng di truyền của gà Việt Nam với một số quần thể gà châu Á 59 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc của ty thể . 09 Hình 1.2. Sơ đồ mtDNA gà . . 12 Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của một số mẫu gà nghiên cứu . . 35 Hình 3.2. So sánh trình tự vùng D-loop của 71 mẫu gà nghiên cứu với trình tự mang mã số GenBank AP003580 50 Hình 3.3. Hai đa hình phổ biến nhất của các mẫu nghiên cứu C197T và T426C . 52 Hình 3.4. Tỷ lệ % các kiểu thay thế nucleotide của 71 mẫu nghiên cứu . . 53 Hình 3.5. Tần số phân bố của các kiểu đơn bội vùng D-loop hệ gen ty thể 3 giống gà nghiên cứu . . 56 Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại của 3 giống gà nghiên cứu . 60
