Tiến Sĩ Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin bằng phương pháp p

MỞ ĐẦU
Chất diệt cỏ chứa dioxin (chất diệt cỏ/dioxin) là một trong số các chất hữu cơ chứa clo độc hại không chỉ với môi trường, con người mà còn khó bị phân hủy bởi vi sinh vật (VSV). Xử lý ô nhiễm các chất hữu cơ chứa clo nói chung và chất diệt cỏ/dioxin nói riêng bằng biện pháp phân hủy sinh học (bioremediation) đã và đang được nghiên cứu do chi phí thấp và thân thiện đối với môi trường. Các nghiên cứu về quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo đã chứng minh có 4 con đường phân hủy, chuyển hóa bởi VSV. Trong số đó có 3 con đường xảy ra với sự có mặt của oxy bao gồm oxy hóa cắt vòng thơm, loại clo ở sản phẩm cắt vòng và phân hủy nhờ cơ chế xúc tác bởi enzyme ngoại bào hay các chất tương tự trao đổi chất hoạt động như enzyme. Quá trình thứ tư là loại khử clo xảy ra ở điều kiện không có oxy hay thiếu oxy được gọi chung là hô hấp loại khử clo.
Công nghệ phân hủy sinh học đã được áp dụng thành công với quy mô 0,5 m3 đến 100 m3 tại Đà Nẵng và quy mô 3.384 m3 tại Biên Hòa. Hiệu quả xử lý tại Đà Nẵng đạt 50 – 70% sau gần 2 năm xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005) và tại Biên Hòa đạt hơn 99% sau 27 tháng xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Để đạt được hiệu quả xử lý nêu trên có rất nhiều yếu tố liên quan trong đó có vai trò của VSV, các điều kiện mini sinh thái của mỗi lô xử lý, các nhóm VSV tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy và khoáng hóa các hợp chất là thành phần chất diệt cỏ/dioxin. Đặc biệt, sự đa dạng và mức độ hoạt động của quần xã vi khuẩn kỵ khí (VK KK) hô hấp loại khử clo tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy sinh học các chất độc như thế nào vẫn đang là những câu hỏi cần được giải đáp bằng các nghiên cứu cơ bản với sự hỗ trợ của các kỹ thuật hiện hành.
Hiện nay, các nghiên cứu về VK hô hấp loại khử clo trên thế giới đã công bố có 20 chi và thuộc về 3 ngành là Proteobacteria, Chloroflexi và Firmicute. Trong các lô xử lý ở Đà Nẵng, sự có mặt VK Dehalococcoides thuộc ngành Chloroflexi đã được xác định bằng phương pháp DGGE (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Một số VK KSF thuộc ngành Proteobacteria cũng đã được phát hiện tại khu vực này. Đặc biệt,
2
nhóm VK hô hấp loại khử clo theo cơ chế đồng trao đổi chất mà đại diện là Pseudomonas đã được phát hiện ở hầu hết các nghiên cứu ở Việt Nam (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Chúng không chỉ có mặt trong các mẫu nguyên thủy mà còn luôn được tìm thấy ở hầu hết các mẫu của quá trình xử lý ở các quy mô khác nhau trong điều kiện thiếu khí. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sâu nào về nhóm VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo một cách có hệ thống. Đặc biệt, việc làm giàu các VK KK hô hấp loại khử clo bắt buộc bắt đầu được nghiên cứu nhưng chưa thành công. Để tìm hiểu sự có mặt và vai trò của nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học”.
Luận án được thực hiện với các mục đích và nội dung chính sau đây:
Mục đích nghiên cứu
 Đánh giá sự đa dạng VK KK trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu VK KK hô hấp loại khử clo bằng phương pháp sinh học phân tử.
 Đánh giá sự đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm trong mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo từ mẫu đất ở lô xử lý của Biên Hòa.
 Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu bởi quần xã VK KK hô hấp loại khử clo.
Nội dung nghiên cứu
 Xác định sự có mặt của một số nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý bằng phương pháp nested-PCR.
 Nghiên cứu sự đa dạng VK KSF và Dehalococcoides từ các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa bằng phương pháp DGGE.
 Đánh giá sự biến động số lượng VK KK sử dụng dioxin và VK KSF trong lô xử lý 3.384 m3 tại Biên Hòa.
3
 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của quần xã VK KSF và một chủng đại diện được làm giàu, phân lập từ các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam.
 Đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các đồng phân PCDD/Fs và các hợp chất vòng thơm từ mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo và VK KSF.
 Sử dụng công cụ Metagenomics để nghiên cứu sự đa dạng của quần xã VK KK cũng như các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin có mặt trong mẫu làm giàu từ đất của 16 vị trí ở lô xử lý khử độc tại Biên Hòa sau 36 tháng.
Phương pháp nghiên cứu
1. Phương pháp sinh học phân tử: nested-PCR, DGGE, Metagenomics được sử dụng để đánh giá sự đa dạng VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu.
2. Phương pháp nuôi cấy truyền thống: nuôi cấy, làm giàu VK KK trong phòng thí nghiệm và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng của các VK này.
3. Phương pháp hóa học: phân tích các thành phần hóa học trên máy HPLC và GC/MS để đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các chất là thành phần của chất diệt cỏ như các đồng phân của dioxin, 2,4,5-T và sản phẩm phân hủy sinh học của chúng như 2,4-DCP bởi các VK KK trong các mẫu làm giàu từ đất của lô xử lý ở Đà Nẵng, Biên Hòa.

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
i
Lời cam đoan
ii
Mục lục
iii
Danh mục các thuật ngữ và ký hiệu viết tắt
viii
Danh mục các bảng
x
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
xi
MỞ ĐẦU
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
5
1.1. Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo
5
1.1.1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất hữu cơ chứa clo
5
1.1.2. Ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ chứa clo tới con người và môi trường
7
1.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo
8
1.2.1. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo trên thế giới
8
1.2.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo ở Việt Nam
9
1.2.2.1. Ô nhiễm các hợp chất hữu cơ nói chung
9
1.2.2.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Biên Hòa
10
1.2.2.3. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Đà Nẵng
11
1.2.2.4. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Phù Cát
11
1.3. Phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo
12
1.3.1. Cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo
12
1.3.2. Phân hủy hiếu khí chất diệt cỏ/dioxin
17
1.3.2.1. Phân hủy hiếu khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy
17
1.3.2.2. Phân hủy hiếu khí các hợp chất dioxin
18
1.3.3. Phân hủy kỵ khí chất diệt cỏ/dioxin
20
1.3.3.1. Phân hủy sinh học kỵ khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy
20
1.3.3.2. Phân hủy kỵ khí các hợp chất dioxin
21
iv
1.4. Đa dạng các vi khuẩn tham gia hô hấp loại khử clo
21
1.4.1. Đặc điểm chung của các vi khuẩn hô hấp loại khử clo
21
1.4.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate
25
1.4.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides
28
1.4.4. Đa dạng vi khuẩn Pseudomonas
30
1.5. Đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình loại khử clo
32
1.6. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng vi sinh vật
36
1.6.1. Phương pháp vi sinh vật
36
1.6.2. Phương pháp hóa sinh
37
1.6.3. Phương pháp sinh học phân tử
37
1.6.4. Phương pháp Metagenomics
38
1.7. Các phương pháp làm sạch nguồn ô nhiễm dioxin và các hợp chất tương tự bằng phân hủy sinh học
42
1.8. Nghiên cứu về phân hủy sinh học chất diệt cỏ chứa dioxin ở Việt Nam
45
1.8.1. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng
46
1.8.2. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Biên Hòa
48
1.8.3. Các nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa và loại khử clo ở Việt Nam
49
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
52
2.1. Vật liệu
52
2.1.1. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Đà Nẵng
52
2.1.2. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Biên Hòa
52
2.1.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi đã sử dụng
53
2.1.4. Các hóa chất và thiết bị máy móc
54
2.1.5. Thành phần các môi trường nuôi cấy và dung dịch đã sử dụng
55
2.1.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy
55
2.1.5.2. Các dung dịch đã sử dụng
56
2.2. Phương pháp
56
2.2.1. Chiết các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin từ đất
56
2.2.2. Tách DNA tổng số
57
v
2.2.3. Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí từ các lô xử lý
57
2.2.3.1. Nested-PCR
57
2.2.3.2. DGGE
58
2.2.4. Xác định trình tự nucleotide và xây dựng cây phát sinh chủng loại
59
2.2.5. Đánh giá sự biến động các vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa
59
2.2.6. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí
59
2.2.6.1. Làm giàu vi khuẩn khử sulfate
59
2.2.6.2. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo
60
2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên sự sinh trưởng của quần xã vi khuẩn khử sulfate
61
2.2.8. Làm sạch vi khuẩn khử sulfate
61
2.2.9. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn
62
2.2.10. Tách dòng đoạn gene mã hóa 16S rRNA
62
2.2.11.Đánh giá khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo (đa) vòng thơm
62
2.2.11.1. Đánh giá khả năng phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ
62
2.2.11.2.Đánh giá khả năng phân hủy các đồng phân dioxin trong mẫu làm giàu
63
2.2.11.3. Xác định 2,4-DCP và 2,4,5-T
64
2.2.12.Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí và gene chức năng trong mẫu làm giàu
65
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
67
3.1. Đa dạng vi khuẩn loại khử clo trong các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin
68
3.1.1. Đa dạng vi khuẩn hô hấp loại khử clo nói chung trong các lô xử lý
68
3.1.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate trong các lô xử lý
69
3.1.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides trong các lô xử lý
72
3.2. Sự đa dạng vi khuẩn và các gene chức năng trong mẫu làm giàu
74
3.2.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo trên đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin
74
3.2.2. Sự đa dạng vi khuẩn trong mẫu làm giàu
75
3.3. Sự biến động số lượng vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý tại Biên Hòa
80
vi
3.3.1. Sự biến động số lượng vi khuẩn khử sulfate trong lô xử lý
80
3.3.2. Sự biến động số lượng vi khuẩn kỵ khí sử dụng chất diệt cỏ/dioxin tại lô xử lý
81
3.4. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào
81
3.4.1. Sự có mặt của các gene reductive dehalogenase (rdhA) trong các lô xử lý và trong mẫu làm giàu
81
3.4.2. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào phát hiện bằng Metagenomics
82
3.4.3. So sánh trình tự một số gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia vào quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm
84
3.5. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn khử sulfate
87
3.5.1. Làm giàu quần xã vi khuẩn khử sulfate
87
3.5.2. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sinh trưởng của quần xã vi khuẩn khử sulfate
87
3.5.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
88
3.5.2.2. Ảnh hưởng của pH
88
3.5.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl
89
3.5.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon
90
3.5.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết đất
91
3.5.2.6. Ảnh hưởng của một số hợp chất chứa clo hữu cơ
91
3.5.3. Phân lập, phân loại vi khuẩn khử sulfate
92
3.5.3.1. Quan sát hình thái tế bào
93
3.5.3.2. Trình tự đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu cho vi khuẩn khử sulfate
93
3.6. Sự có mặt của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu
94
3.6.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí loại khử clo trên nguồn DCĐ, 2,4,5-T, 2,4-DCP
95
3.6.2. Hình thái một số tế bào vi khuẩn trong mẫu làm giàu trên các chất ô nhiễm
96
3.6.3. Nhân đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu của vi khuẩn Dehalococcoides
97
3.6.4. Trình tự đoạn gene 16S rRNA của Deh