Tiến Sĩ Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2015
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1 Tính cấp thiết của đề tài 1
2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 3
3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4
4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4
5 Những đóng góp mới của luận án 5
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6
1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam 6
1.1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới 6
1.1.2 Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam 7
1.2 Phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra đối với sản xuất lạc 8
1.3 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 10
1.4 Phân loại và phổ ký chủ của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 11
1.5 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn R. solanacearum 12
1.5.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo 12
1.5.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R. solanacearum 13
1.5.3 Phương thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R. solanacearum 14
1.5.4 Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của
bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 15
1.5.5 Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc và phân lập vi khuẩn gây bệnh 16
1.6 Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn héo xanh hại lạc 17
1.6.1 Biovar và nòi của vi khuẩn R. solanacearum 17
1.6.2 Chủng 18 1.6.3 Loài phức 19
1.6.4 Kiểu gây bệnh 19
1.6.5 Kiểu quan hệ phả hệ 19
1.7 Nghiên cứu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 20
1.7.1 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng giống kháng bệnh 20
1.7.2 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng các biện pháp khác 22
1.8 Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc và
chọn lọc giống kháng bệnh 25
1.8.1 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ký sinh gây bệnh và chọn giống
kháng bệnh 25
1.8.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo
xanh hại lạc và chọn lọc giống kháng bệnh 28
CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
2.1 Nội dung nghiên cứu 36
2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37
2.3 Vật liệu nghiên cứu 37
2.4 Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu 39
2.4.1 Môi trường, hóa chất sử dụng trong phân lập vi khuẩn, phản ứng sinh hóa 39
2.4.2 Môi trường, hóa chất sử dụng trong PCR 40
2.5 Phương pháp nghiên cứu 40
2.5.1 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng 40
2.5.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 41
2.5.3 Phương pháp thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh
héo xanh lạc 41
2.5.4 Phương pháp xác định biovar của vi khuẩn R.solanacearum 42
2.5.5 Phương pháp thí nghiệm một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển
của vi khuẩn R. solanacearum thuộc các biovar khác nhau gây bệnh
héo xanh hại lạc 43
2.5.6 Phương pháp phân tích ADN 44 2.5.7 Phương pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo đánh giá khả năng chống chịu
bệnh HXVK của nguồn vật liệu 48
2.5.8 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng đánh giá tập đoàn và so sánh giống 49
2.5.9 Chỉ tiêu theo dõi 50
2.5.10 Phương pháp xử lý số liệu 51
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 52
3.1 Điều tra, thu thập và phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh
trồng lạc miền Bắc Việt Nam 52
3.1.1 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền
Bắc Việt Nam 52
3.1.2 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 54
3.1.3 Phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc
Việt Nam 55
3.1.4 Thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 58
3.2 Nghiên cứu biovar và đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum gây
bệnh héo xanh hại lạc 60
3.2.1 Xác định biovar, nòi một số isolate vi khuẩn R. solanacearum 60
3.2.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển khuẩn lạc của một số
isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc thuộc các
biovar khác nhau 63
3.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R.
solanacearum bằng phân tích ADN 67
3.2.4 Sự phân bố các biovar và đa dạng di truyền của một số isolate vi khuẩn
R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 72
3.3 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn
mẫu giống lạc, dòng lai và dòng triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân
tạo và chọn lọc dòng, giống kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 78
3.3.1 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn
mẫu giống lạc bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc mẫu giống
kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 78 3.3.2 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng
lạc từ các tổ hợp lai đơn bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc
dòng có khả năng kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 92
3.3.3 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng
lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn
lọc dòng lạc kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 101
3.3.4 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng
lạc ưu tú bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng có khả năng
kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 109
3.3.5 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng
lạc triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng kháng
bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 115
3.3.6 Kết quả khảo nghiệm Quốc gia giống lạc triển vọng 125
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 128
1 Kết luận 128
2 Đề nghị 129
Danh mục các công trình khoa học đã công bố liên quan đến luận án 130
Tài liệu tham khảo 131
Phụ lục 144
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày thuộc họ đậu, có
nguồn gốc ở Nam Mỹ và được trồng ở trên 100 quốc gia thuộc cả 6 châu lục. Lạc là
cây trồng có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao, là cây công nghiệp đứng thứ 2
trong các cây lấy dầu thực vật. Sản phẩm chế biến từ lạc rất đa dạng, trong đó chủ
yếu từ hạt. Hạt lạc là nguồn nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp chế biến và
khô dầu. Bên cạnh giá trị dinh dưỡng, giá trị kinh tế, cây lạc còn có thể trồng xen,
trồng gối với những cây trồng khác góp phần cải tạo đất, chuyển dịch cơ cấu cây
trồng nông nghiệp tăng thêm nguồn thu nhập cho người sản xuất.
Ở Việt Nam, lạc đang là một trong số các mặt hàng nông sản xuất khẩu quan
trọng. Ngoài ra, lạc còn là cây trồng có khả năng thích ứng rộng, không đòi hỏi đầu
tư phân bón cao do bộ rễ có khả năng cố định đạm, tạo ra lượng đạm sinh học cung
cấp cho cây và làm tăng độ phì cho đất. Hiện nay, lạc là cây họ đậu chính tham gia
vào các công thức luân canh, xen canh mang tính bền vững và thân thiện với môi
trường. Trong hơn 100 quốc gia trồng lạc trên thế giới, Việt Nam đứng thứ 10 về
diện tích và trong 25 nước trồng lạc ở châu Á, Việt Nam đứng thứ 5 về diện tích
gieo trồng sau Ấn Độ, Trung Quốc, Myanma và Indonesia (FAO, 2013).
Tại Việt Nam, mặc dù có nhiều lợi thế về điều kiện tự nhiên nhưng năng suất
và sản lượng lạc tăng chưa tương xứng với tiềm năng. Nguyên nhân chủ yếu là hầu
hết các địa phương trồng lạc, đặc biệt là vùng đất trồng lạc nhờ nước trời như đất
đồi gò, đất bãi ven sông thường bị bệnh gây hại, trong đó bệnh héo xanh do vi
khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là đối tượng gây hại nặng trên cây lạc.
Trên thế giới, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở hầu hết các vùng
trồng lạc như Ấn Độ, Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Mỹ, Nhật Bản, Papua New
Guinea, Philippines, Thái Lan, Sri Lanka, Trung Quốc, Uganda, Việt Nam,
(He, 1986; Hayward, 1990; Mehan et al., 1994; Lam và Hamidah, 1995). Bệnh
HXVK gây hại nghiêm trọng trên cây lạc với tỷ lệ cây nhiễm bệnh trung bình từ 5%



đến 20% (Mehan et al., 1986), thậm chí có những cánh đồng bị nhiễm nặng có thể
tới 100% (Tan et al., 1994). Ở Việt Nam, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc được coi là bệnh hại phổ biến
ở nhiều tỉnh trồng lạc trong cả nước như: Bắc Giang, Bắc Ninh, Ninh Bình, Thanh
Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Long An, Tây Ninh, . (Mehan và cs., 1991; Nguyễn
Xuân Hồng và cs., 1997; Lê Lương Tề, 1997a). Bệnh gây hại nghiêm trọng ở một
số vùng trọng điểm ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa với tỷ lệ bệnh dao động trong
khoảng 15% đến 35% và ở vùng trồng lạc của tỉnh Long An và Tây Ninh là từ
20% đến 30%.
Năm 1896 nhà bác học Smith là người đã phát hiện vi khuẩn R. solanacearum
gây ra bệnh héo xanh (Hayward, 1990). Bệnh HXVK gây hại nặng ở vùng nhiệt
đới, á nhiệt đới và các vùng có nhiệt độ ấm áp. Phạm vi ký chủ của bệnh rộng, gây
hại trên 400 loài cây trồng thuộc 80 họ thực vật khác nhau. Vi khuẩn có thể tồn tại
lâu trong hạt giống, trong đất và cỏ dại, chính vì vậy việc phòng chống bệnh gặp
nhiều khó khăn.
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn
hại lạc ở trong nước và trên thế giới như biện pháp luân canh, sinh học, hóa học,
bằng giống kháng bệnh . Tuy nhiên sử dụng giống lạc kháng bệnh là biện pháp chủ
động và có hiệu quả trong phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn (Liao, 2005a).
Trong thời gian qua, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện
Bảo vệ thực vật đã chọn tạo thành công một số giống lạc kháng bệnh héo xanh vi
khuẩn như giống MD7 và giống TK10 phát triển ở một số vùng thường bị bệnh gây
hại góp phần hạn chế tác hại của bệnh. Tuy nhiên, các giống này sản xuất liên tục
trong thời gian dài nên bị thoái hóa, năng suất và khả năng kháng bệnh giảm dần.
Công tác chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở nước ta đã đạt
được những kết quả đáng khích lệ, tuy nhiên chủ yếu theo phương pháp truyền
thống nên hiệu quả tích lũy các gen kháng bệnh vào con lai còn khó khăn và mất
thời gian dài. Đến nay ở nước ta chưa có nghiên cứu nào về sử dụng chỉ thị phân tử
để chọn giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn được công bố. Các nghiên cứu
mới chỉ khảo sát đánh giá mức độ kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của mẫu giống lạc
bằng quan sát, đánh giá bệnh trong điều kiện nhân tạo và đánh giá ở các khu vực có
nguồn bệnh trong điều kiện sản xuất. Để rút ngắn thời gian trong việc chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi
khuẩn, ứng dụng chỉ thị phân tử là con đường ngắn và hiệu quả, không những góp
phần hạn chế tác hại của bệnh mà còn hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trong
phòng chống bệnh, bảo vệ môi trường và tạo sự đa dạng sinh học đối với cây lạc (Liao
et al., 2005b; Peng et al., 2011; Ding et al., 2012). Trong chọn tạo giống lạc kháng
bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử, cần xác định biovar, nòi và đánh giá đa
dạng di truyền của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc đồng thời phải chọn lọc được
nguồn vật liệu các dòng, giống lạc mang gen kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo và
chỉ thị phân tử, từ đó làm cơ sở chọn tạo ra các dòng, giống lạc mới mang gen kháng
với biovar, nòi vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc phổ biến ở các vùng sản xuất.
Nhằm giải quyết được các yêu cầu quản lý bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc
trong sản xuất tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, việc thực hiện đề tài “Nghiên
cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo
xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền Bắc
Việt Nam” mang tính thời sự cấp thiết.
2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
2.1. Mục tiêu
Xác định được đa dạng di truyền của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo
xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam và dòng, giống lạc kháng
bệnh bằng đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử làm cơ sở phòng chống
bệnh có hiệu quả.