Luận Văn Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa

Cây dứa (Ananas comosus) là loại cây ăn quả nhiệt đới rất được ưa chuộng
trên thế giới bởi hương vị đặc trưng và giàu dinh dưỡng (vitamin, acid hữu cơ ).
Trong các giống dứa chính, dứa Cayenne mang nhiều đặc điểm của công nghệ chế
biến đồ hộp nên đang được trồng rất phổ biến trên thế giới. Hiện nay, cây dứa nói
chung và dứa Cayenne nói riêng đang nằm trong chương trình cung cấp giống cây
chất lượng cao của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn thành phố Hồ Chí
Minh. Để phát triển tốt hơn nữa ngành dứa ở vùng này thì điều trước tiên là phải
đánh giá đa dạng di truyền nguồn dứa để phục vụ công tác chọn giống và lai giống.
Bên cạnh đó, cây dứa Cayenne có nhược điểm chính là có nhiều sâu bệnh phá
hại, đặc biệt là bệnh wilt – héo đỏ đầu lá. Bệnh này do virus “Pineapple Mealybug
Wilt-associated Virus” (PMWaV) gây ra. Bệnh làm cây dứa tăng trưởng kém, trái
teo nhỏ, không thành thương phẩm. Bệnh cũng gây tác hại lên hệ thống rễ và làm
vàng lá, gây suy thoái toàn bộ cây. Điều đáng quan ngại là, nhiều cây mang mầm
bệnh ẩn nhưng bên ngoài vẫn phát triển bình thường gây khó khăn cho việc kiểm
soát bệnh đặc biệt là khâu giống. Về lâu dài, để chống lại bệnh này chỉ còn cách
dùng công nghệ sinh học để tạo ra các giống dứa có tính kháng bệnh.
Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính
kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne (Ananas comosus) bằng phương
pháp RAPD ” được thực hiện với hy vọng là cơ sở để thực hiện có hiệu quả việc lai
tạo giống đồng thời tạo cơ sở cho việc chọn ra giống dứa có khả năng kháng tự
nhiên đối với bệnh héo đỏ đầu lá, góp phần bảo vệ năng suất, phẩm chất của cây
dứa, mang lại hiệu quả kinh tế cho nông dân và xã hội.

1.2. Mục tiêu, nội dung và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu
Phân tích đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan,
Lâm Đồng tại Tp. Hồ Chí Minh.
Xác đinh marker RAPD liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên dứa
Cayenne.
1.2.2. Nội dung
Đánh giá đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne tại Tp. Hồ Chí Minh.
Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne.
Xác Định marker liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ đầu lá.
1.2.3. Yêu cầu
Ly trích DNA tổng số từ lá dứa.
Thực hiện PCR với mồi RAPD để xác định sự đa dạng di truyền của các giống
dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng tại Tp. Hồ Chí Minh.
Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa.
Thực hiện PCR với mồi RAPD để xác định band đa hình liên kết tính kháng
bệnh héo đỏ đầu lá dứa.

2.2.5. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR , bằng cách sử dụng những primer ngắn
(khoảng 10 nucleotide). Nêu 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, khi thực hiện phản ứng
PCR – RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều
dài các đoạn tương ứng bằng nhau. Khi có khác biệt giữa các cá thể thì sẽ có sự thay
đổi về số lượng và vị trí bắt cặp ngẫu nhiên nên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các
đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể.

2.3. Các phương pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài [3]
Tất cả các phương pháp nghiên cứu sự đa dạng của quần thể đều cho kết qủa
cuối cùng là các dữ liệu phân tử phức tạp như các băng vạch trên bảng điện di hoặc
thông tin trình tự DNA, RNA, protein. Để lấy được các thông tin sinh học từ dữ liệu
thô này, các nhà khoa học cần đến sự hỗ trợ của máy tính với các phần mềm phân
tích dữ liệu thực nghiệm. Các thông số về độ đa dạng kiểu gene, độ đa dạng kiểu
hình, khoảng cách gene giữa các cá thể được tính toán theo phương trình của Dice
(1979). Từ các thông tin này, cây phát sinh loài sẽ được xây dựng khi dùng các
phương pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic),
Neighbor Joining, Transformed distance, Neighbors-relation, Maximum parsimoni
hoặc Maximum likehood, Minimum evolution. Trong các phương pháp trên thì
phương pháp UPGMA là phương pháp đơn giản nhất và đang được sử dụng phổ
biến nhất.
UPGMA phản ánh mức tương tự kiểu hình giữa các OTU (Operational
Taxonomic Unit) (đại diện cho các cá thể ) với cac bước sau: Trươc tiên tạo ma trận
tương quan giữa các OTU từ dữ liệu đa hình; với ma trận trên, thuật toán sẽ nhóm
một cặp OTU có khoảng cách nhỏ nhất (có mức tương đồng gene cao nhất) với giá
trị bằng nửa khoảng cách giữa hai OTU; sau đó, cặp đơn vị tiến hóa này được xem
như một OTU mới và khoảng cách giữa OTU mới này với một OTU khác là trung
bình khoảng cách giữa OTU đó với OTU còn lại trong nhóm. Thuật toán tiếp tục
nhóm các OTU có khoảng cách nhỏ nhất cho đến khi chỉ còn có hai OTU . Sau cung
là tạo một cây tiến hóa có gốc.
Để đánh giá độ chính xác của cây phân loài thì phương pháp thông dụng nhất
là dựng bootstrap. Nguyên tắc của phương pháp này là thay đổi các thông số của ma
trận khoảng cách để tạo ra nhiều ma trận khoảng cách khác có cùng kích thước với
ma trận gốc. Mỗi một ma trận tạo ra sẽ lập thành một cây phát sinh loài. Độ tin cậy
của 1 phân nhóm được đánh giá dựa vào mức độ lập lại của phân nhóm đó.
2.4. Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng
di truyền dứa trên Thế Giới và Việt Nam [4]

2.4.1. Nghiên cứu trên Thế Giới
Hiện nay, nhu cầu sản lượng dứa trên thế giới dùng cho chế biến ngày càng
tăng đòi hỏi các nhà chọn giống phải tạo ra những giống có chất lượng phù hợp với
nhu cầu thị trường. Vì thế, nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trên dứa đã
được thực hiện và thành công với sự đóng góp của các loại marker (chỉ thị) phân tử
nhằm cung cấp những thông tin về di truyền để chọn giống chính xác hơn. Những
thành công được thể hiện qua những nghiên cứu sau:
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền dứa bằng marker AFLP ( Cecilia Y. Kato và
ctv, 1992). Sự đa dạng di truyền được tiến hành trên 70 giống dứa (Ananas comosus
L) và 3 họ có liên quan (Ananas ananassoidies, Ananas bracteatus và Ananas
erctifolius). Kết quả cho thấy việc lai khác loài giữa A. comonus và A.
ananassoidies với mức tương quan của A. comonus (0,398) và A.ananassoidies
(0,381). Qua đó cho thấy sự khác biệt di truyền trong số các giống dứa phần lớn có
thể do đột biến.
Phân tích đa dạng di truyền phân tử dứa bằng marker RFLP (Duval và ctv,
2001) đã cho thấy được sự giống nhau giữa Ananas comosus và Pseudananas
comosus là 58,7% qua sử dụng 18 probe tương đồng để lai.
Xác định đặc tính của phôi dứa (Ananas spp) bằng marker AFLP: 40 giống
(dòng) dứa được thu thập và xác định mức độ đa hình giữa các giống, đặc tính của
chúng. Sự phân nhóm di truyền đã chỉ rõ mối liên quan giữa các nhóm và sự khác
biệt với các loài hoang dại. Sự khác biệt này do tự bản thân giống hoặc do yếu tố
môi trường, tỷ lệ đột biến và sự khác biệt dòng soma.
Xác định độ tin cậy kiểu gene của cây dứa vi nhân giống liên quan đến marker
isozyme và RAPD (Sergio Feuse và ctv, 2003).
Đánh giá sự liên quan di truyền của giống dứa Ananas và Pseudananas bằng
marker RAPD (Claudete de Fátima Ruas1và ctv, 2001).

2.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam
Ở nước ta, hiện nay đã có một số viện nghiên cứu và các trường đại học đã tiến
hành nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gene bằng các kỹ thuật sinh học
phân tử như RAPD, AFLP, SSR Tuy số lượng của các nghiên cứu này chưa
nhiều nhưng đã cho thấy chúng ta có khả năng thực hiện những nghiên cứu sử dụng
công nghệ tiên tiến nhằm đẩy mạnh công tác chọn tạo giống, vật nuôi, cây trồng.
Dưới đây là một số nghiên cứu đã ứng dụng thành công trên dứa như:
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống (dòng) dứa bằng phương pháp
RAPD (Hoàng Thị Bích Thuỷ và Bùi Văn Lệ, 2004). Kết quả nghiên cứu này đã
phân nhóm được 7 giống (dòng) qua sử dụng 9 loại primer đã xác định được các
quần thể Trung Quốc 220 và Trung Quốc 250; Đắc Lắc và Thái Lan có cùng nguồn
gốc và quần thể dứa Lâm Đồng và Đắc Lắc; Lâm Đồng và Thái Lan là các quần thể
xa nhau về mặt nguồn gốc.
“Nghiên cứu đa dạng nguồn gene dứa Cayenne bằng phương pháp marker
phân tử” (Lê Thị Thanh Tuyền và Nguyễn Thị Lang, 2004). 13 primer RAPD (10
nucleotide) được sử dụng để khảo sát tính đa dạng di truyền của 50 dòng dứa
Cayenne ở đồng bằng Sông Cửu Long (Long Định và viện lúa ĐBSCL). Bên cạnh
phân tích bằng sinh học phân tử đề tài còn tiến hành đánh giá đa dạng nguồn gene
dựa vào dữ liệu kiểu hình với các chỉ tiêu sau: Chiều cao cây, chiều rộng cây, chiều
dài lá, chiều rộng lá, số lá, ngày trổ hoa, trọng lượng trái, hình dạng lá có gai, không
gai hay lá viền (chỉ có gai một phần hoặc ở một số vị trí trên lá như ngọn, gốc hoặc
giữa lá) và màu sắc lá. Kết quả: Phân nhóm di truyền của 50 giống Cayenne dựa
trên dữ liệu sản phẩm PCR - RAPD phân thành 3 nhóm chính, với khoảng cách
phân nhóm là 0,66. Nhóm I gồm 20 dòng dứa, nhóm II gồm 3 dòng và nhóm III là
27 dòng, trong mỗi nhóm đều chứa những dòng dứa có nguồn gốc nhập ngoại và
nhập nội. Sự tương đồng về di truyền giữa nhóm I hoặc nhóm II với nhóm III là 49
% và nhóm I với nhóm II là 63%; trong cùng một nhóm thì nhóm III có mức tương
đồng về di truyền cao nhất 71%. Khoảng cách di truyền giữa 50 dòng dứa Cayenne
qua phân nhóm dao động từ 0,27 – 1,0 với những dòng dứa được trồng từ dạng nuôi
cấy mô có sự tương đồng về di truyền cao nhất.
Bên cạnh đồng bằng Sông Cửu Long, nơi cung cấp dứa có chất lượng thì Tp.
Hồ Chí Minh cũng là vùng dứa lớn. Để phát triển tốt hơn ngành dứa ở vùng này thì
điều trước tiên là phải đánh giá về đa dạng di truyền nguồn dứa để phục vụ công tác
chọn giống và lai giống.

2.5. Bệnh héo do virus [1]
Bệnh héo đỏ đầu lá hiện diện ở hầu hết các vùng trồng dứa trên thế giới. Theo
Sether D.M. và Hu J.S. (2002), bệnh đã xuất hiện ở Mỹ, Đài Loan, Singapore,
Brazil, Jamaica, Philippines, Venezuela, Thái lan, Malaysia và cả ở Việt Nam.
Đây là bệnh rất nguy hiểm và ảnh hưởng lớn đến nghề trồng dứa. Không như
các bệnh khác trên dứa do vi khuẩn, nấm hay tuyến trùng đều có các loại thuốc
phòng trị đặc hiệu, bệnh héo đỏ đầu lá cho đến nay vẫn chưa có biện pháp phòng trừ
triệt để ngoài việc hạn chế sự lây lan là diệt môi giới truyền bệnh (Trần Thế Tục và
Vũ Mạnh Hải, 2001).
Bệnh do virus PMWaV gây ra. Virus được bảo tồn và lan truyền sang đời sau
chủ yếu qua chồi giống và tàn dư của cây bệnh. Những chồi giống mang mầm bệnh
lại thường chỉ biểu hiện triệu chứng vào giai đoạn cây đang phân hóa mầm hoa trở
đi, tức là sau một thời gian trồng rất dài (9 - 12 tháng). Chính đặc điểm này của
bệnh héo đỏ đầu lá đã gây nên những thiệt hại kinh tế to lớn cho người trồng dứa
(Borroto E.G. và cs, 1998).

2.5.1. Lịch sử phát hiện virus PMWaV [14] [12] [16] [17]
Trong những năm 1920, người trồng dứa ở Hawaii nhận thấy có nhiều kiến
trong các vùng trồng dứa bị bệnh. Họ cho rằng kiến là nguyên nhân gây bệnh và tìm
cách tiêu diệt kiến để bảo vệ vườn dứa.
Illingworth (1931) đã chứng minh rằng kiến không phải là nguyên nhân gây
bệnh mà rệp sáp mới là nguyên nhân gây bệnh. Carter (1939) báo cáo rằng nước bọt
của rệp sáp gây độc cho dứa dựa trên các quan sát sau : Bệnh xảy ra khi có 1 lượng
lớn rệp hiện diện trên dứa; có mối quan hệ bằng thực nghiệm giữa số lượng rệp,
thời gian rệp tồn tại trên dứa với cừơng độ bệnh; cây phục hồi khi rệp bị diệt. Carter
và Schmidt (1935) thực hiện thí nghiệm xác định số lượng rệp tối thiểu để gây bệnh
héo đỏ đầu lá. Tuy nhiên tỉ lệ mắc bệnh lại không khác biệt có ý nghĩa giữa lô chỉ
thả 1 rệp với lô đối chứng không có rệp, do lô chỉ thả 1 rệp chỉ có vài cây biểu hiện
bệnh. Carter kết luận 1 rệp cũng có thể gậy bệnh và bệnh có thời gian ủ bệnh có thể
tới 2 tháng.
Gunasinghe và German (1989), Maramorosch và cộng sự (1984), Ullman và
cộng sự (1989) đã phân lập được 1 loại closterovirus hình que trên các cây dứa có
và không có triệu chứng bệnh và gọi là Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus
(PMWaV). Hu và cộng sự (1996) phát hiện PMWaV trên rệp thu từ các cây dứa
bệnh mà không phát hiện PMWaV trên rệp thu từ bí đỏ. Các nghiên cứu này đã
chứng minh được PMWaV là nguyên nhân chính gậy ra bệnh héo đỏ đầu là trên
dứa.
Melzer và cộng sự (2001) đã phát hiện có ít nhất 2 loại PMWaV (PMWaV-1,
PMWaV-2) gây bệnh trên dứa. Sether và Hu (2002) chứng minh rằng bệnh chỉ biểu
hiện triệu chứng khi có sự xâm nhiễm của rệp sáp và virus PMWaV-2, bệnh không
biểu hiện triệu chứng khi không có rệp hoặc cây có rệp mà chỉ nhiễm PMWaV-1.
Sether, Hu, Melzer, Busto và Zee (2004) thực hiện RT-PCR với primer thoái hóa
cho protein HSP-70 đã phát hiện thêm 2 loại PMWaV là PMWaV-3 và PMWaV-4.
Như vậy cho đến nay đã phát hiện được 4 loại PMWaV trên dứa có biểu hiện triệu
chứng bệnh nhưng chỉ có PMWaV-2 gây biểu hiện triệu chứng theo nghiên cứu của
Sether và Hu (2002).

MỤC LỤC
CHƯƠNG TRANG
Lời cảm ơn . iii
Tóm tắt iv
Summary v
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt x
Danh sách các hình và biểu đồ xi
Danh sách các bảng xiii
Chương 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục tiêu, nội dung và yêu cầu của đề tài 2
1.2.1. Mục tiêu . 2
1.2.2. Nội dung . 2
1.2.3. Yêu cầu . 2
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu chung về cây dứa . 3
2.1.1. Phân loại và nguồn gốc 3
2.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa . 3
2.1.2.1. Việt Nam 3
2.1.2.2. Thế giới . 4
2.1.3. Các nhóm dứa chính . 5
2.1.3.1. Nhóm Queen . 5
2.1.3.2. Nhóm Tây Ban Nha 6
2.1.3.3. Nhóm Cayenne 7
2.2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị 7
2.2.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị 7
2.2.2. Chỉ thị hình thái . 8
2.2.3. Chỉ thị isozyme 8
2.2.4. Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA 9
2.2.5. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 10
2.3. Các phương pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài . 11
2.4. Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di
truyền dứa trên Thế Giới và Việt Nam . 12
2.4.1. Nghiên cứu trên Thế Giới 12
2.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam . 13
2.5. Bệnh héo do virus 14
2.5.1. Lịch sử phát hiện virus PMWaV 14
2.5.2. Tác nhân lây truyền bệnh . 16
2.5.3. Triệu chứng 18
2.5.4. Cách phòng trị 19
2.6. Marker liên kết tính kháng bệnh trên thực vật. . 20
2.6.1. Tính kháng bệnh trên thực vật . 20
2.6.1.1. Kháng bệnh đơn gene (monogenic resistance) . 21
2.6.1.2. Kháng bệnh đa gene (polygenic resistance) hay QTL kháng . 21
2.6.2. Xác định marker phân tử liên kết gen kháng bệnh ở thực vật 21
2.6.3. Một số nghiên cứu phát hiện marker phân tử cho tính kháng bệnh
trên thực vật bằng kỹ thuật RAPD 22
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 23
3.1. Đánh giá đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne tại
Tp. Hồ Chí Minh 23
3.1.1. Thời gian và địa điểm . 23
3.1.2. Đối tượng . 23
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị 23
3.1.4. Hóa chất . 24
3.1.5. Phương pháp tiến hành . 24
3.1.5.1. Ly trích DNA tổng số từ lá dứa 24
3.1.5.2. Tối ưu hoá phản ứng RAPD 26
3.1.5.3. Thực hiện phản ứng RAPD 28
3.1.5.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot 28
3.2. Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne . 30
3.2.1. Thời gian và địa điểm . 30
3.2.2. Đối tượng . 30
3.2.3. Dụng cụ . 30
3.2.4. Phương pháp tiến hành . 31
3.2.4.1. Nuôi rệp . 31
3.2.4.2. Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh 31
3.2.4.3. Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh 32
3.3. Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo đỏ
đầu lá trên dứa Cayenne . 33
3.3.1. Thời gian và địa điểm . 33
3.3.2. Đối tượng . 33
3.3.3. Dụng cụ và thiết bị . 33
3.3.4. Hóa chất . 33
3.3.5. Phương pháp 33
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 35
4.1. Đánh giá đa dạng di truyền của cây dứa Cayenne bằng kỹ thuật RAPD 35
4.1.1. Kết quả ly trích DNA tổng số từ lá dứa . 35
4.1.2. Tối ưu hoá phản ứng RAPD . 35
4.1.3. Thực hiện phản ứng RAPD 36
4.1.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS và Winboot 40
4.2. Gây nhiễm bệnh héo đỏ đầu lá cho dứa Cayenne . 43
4.2.1. Nuôi rệp 43
4.2.2. Chuyển rệp từ bí sang dứa bệnh . 45
4.2.3. Chuyển rệp từ dứa bệnh sang dứa sạch bệnh . 46
4.3. Xác định marker RAPD liên kết kiểu hình không biểu hiện bệnh héo
đỏ đầu lá trên dứa Cayenne 48
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52
5.1. Kết luận . 52
5.2. Đề nghị 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
PHỤ LỤC