Tiến Sĩ Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp

ĐẶT VẤN ĐỀ

“Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh Nội tiết và các Rối loạn chuyển hóa mà điển hình là bệnh đái tháo đường (Bệnh tiểu đường)”. Nhận xét này của nhóm chuyên gia về dự báo tình hình bệnh tật của Tổ chức Y tế thế giới đã đang trở thành hiện thực với những con số cụ thể. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2008) [77], hiện nay trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh tiểu đường và ước tính con số này sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030, chiếm khoảng 5% dân số thế giới. Đáng lo ngại hơn là các biến chứng của bệnh, cứ 10 giây có một người tử vong do nguyên nhân đái tháo đường, cứ 30 giây lại có một người đái tháo đường bị cắt cụt chi và cứ mỗi ngày có 5000 người mất khả năng nhìn do biến chứng mắt của bệnh. Mỗi năm có hơn 3,2 triệu người chết vì các bệnh liên quan tới đái tháo đường tương đương với số người tử vong vì bệnh HIV/AIDS [1]. Bệnh tiểu đường (BTĐ) đang trở thành gánh nặng cho mỗi nền kinh tế xã hội, mặc dù mỗi năm hàng nghìn tỷ đôla Mỹ được chi phí cho điều trị bệnh, nhưng chưa bao giờ và sẽ không bao giờ những chi phí khổng lồ về kinh tế có thể lấp đầy được những tổn thất, nhất là những mất mát về tinh thần do bệnh tật gây ra. Thực tế đáng lo ngại hơn là tình trạng bệnh xuất hiện ngày càng nhiều từ lớp trẻ [1].

Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc BTĐ ngày càng cao và ở các thành phố lớn tỷ lệ này đã tăng gấp đôi từ 2% lên 4% trong 10 năm giai đoạn 1990-2000. Số người mắc BTĐ hiện nay khoảng 4,5 triệu người, chiếm 5,7% dân số, trở thành nước có tốc độ phát triển BTĐ nhanh nhất thế giới [1]. Nguyên nhân của BTĐ là do thiếu insulin hoặc do cơ thể người bệnh kháng insulin. Insulin là một polypeptide hormone được sinh ra nhờ các tế bào β của tuyến tụy động vật, có vai trò điều hoà lượng đường trong máu. Phương pháp điều trị BTĐ phổ biến hiện nay là tiêm insulin định kỳ cho người bệnh. Do số lượng người mắc BTĐ ngày càng cao nên nhu cầu sử dụng insulin càng lớn. Ở châu Âu, lượng insulin đã tăng lên 3 lần trong vòng 12 năm từ 1995-2007. Theo ước tính, nhu cầu insulin trên thế giới tăng từ khoảng 5.000kg trong năm 2007 lên khoảng 16.000kg vào năm 2010, với thị trường dự tính khoảng 11,8 tỷ Mỹ kim [41].

Năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh học Genetech đã dòng hóa thành công gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu hiện trong E. coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sản xuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin. Năm 1982, Humulin đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành. Hiện nay có nhiều công ty dược phẩm trên thế giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis với nhiều loại sản phẩm insulin khác nhau. Công nghệ sản xuất insulin hiện nay thường được tiếp cận theo hai phương pháp: phương pháp một chuỗi polypeptide và phương pháp hai chuỗi polypeptide. Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp bằng phương pháp một chuỗi polypeptide bao gồm ba bước cơ bản. Đầu tiên là bước tạo dòng chủng chủ (thường là E. coli) có khả năng mang gen ngoại tổng hợp các chất tiền thân của insulin (proinsulin). Đây là khâu then chốt quyết định sự thành công của công nghệ do cần phải biến đổi các codon thích hợp để tăng cường hiệu quả biểu hiện. Tiếp theo là bước lên men, cảm ứng biểu hiện, thu nhận proinsulin và xử lý để thu nhận insulin. Protein được biểu hiện dưới dạng thể vùi nằm trong tế bào chất, do vậy cần phải biến tính để làm tan, sau đó tiến hành tái gấp cuộn để có proinsulin có cấu hình tự nhiên. Proinsulin tái gấp cuộn được xử lý bằng protease cắt loại đoạn nối nội phân tử (đoạn peptide C) để thu insulin có hoạt tính. Đối với phương pháp sản xuất theo 2 mạch polypeptide, trước hết phải tạo dòng các chủng chủ riêng rẽ mang các gen mã hóa cho 2 chuỗi polypeptide khác nhau (chuỗi A, chuỗi B). Sau đó tinh chế thu nhận các chuỗi polypeptide A và B và thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide để thu nhận insulin có hoạt tính. Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng insulin rất cao, tuy nhiên toàn bộ nguồn insulin sử dụng cho bệnh nhân mắc BTĐ đều phải nhập ngoại nên vừa gây tốn kém ngoại tệ vừa không chủ động được nguồn thuốc để đáp ứng chữa trị kịp thời cho bệnh nhân. Để đảm bảo cho điều trị toàn bộ bệnh nhân mắc BTĐ hàng ngày với liều dùng 0,5-1,0 U/kg trọng lượng cơ thể trong một ngày [78], thì Việt Nam cần phải nhập ngoại khoảng từ 120-240 triệu U/ năm, tương đương 420-840 kg insulin/ năm (100U =3,5 mg). Năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin tái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, có thể tiếp cận được công nghệ hiện đại để phát triển qui trình sản xuất insulin người tái tổ hợp trong nước, mang lại triển vọng góp phần giải quyết khó khăn trên. Mặc dù bản quyền sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã hết hạn tuy nhiên các công ty dược phẩm vẫn tiếp tục giữ những bí quyết công nghệ có tính thế mạnh của công ty nên rất khó tiếp cận để có được qui trình công nghệ đầy đủ nhằm sản xuất insulin. Do vậy, cần phải nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ riêng dựa trên những thông tin đã công bố và trình độ công nghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin trong nước đáp ứng được yêu cầu đặt ra.

Năm 2007, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trị bệnh đái tháo đường”, mã số KC.04.09/06-10. Nội dung nghiên cứu của luận án là thực hiện một phần trong nội dung của đề tài cấp nhà nước này.
Về mặt khoa học, mục tiêu của luận án nhằm bước đầu nghiên cứu qui trình tổng hợp insulin người tái tổ hợp theo phương pháp một chuỗi polypeptide trong E. coli bao gồm tạo dòng E. coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin, lên men, tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý để tạo insulin có hoạt tính. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công nghệ protein để tạo ra chế phẩm insulin có hoạt tính dùng làm thuốc trị bệnh tiểu đường.

Luận án tập trung nghiên cứu cụ thể các vấn đề sau:

- Tạo chủng E. coli tái tổ hợp có mang vector biểu hiện mini-proinsulin tái tổ hợp của người.
- Xây dựng qui trình lên men nuôi cấy chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin.
- Thiết lập qui trình thu nhận và tinh sạch mini-proinsulin từ tế bào chủng E. coli.
- Xây dựng qui trình tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý thu nhận insulin có hoạt tính.
- Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột.

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC HÌNH viii
DANH MỤC BẢNG .xi
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .5
1.1. Insulin và vai trò đối với cơ thể 5
1.2. Bệnh tiểu đường .8
1.3. Các phương pháp sản xuất insulin 10
1.3.1. Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật 10
1.3.2. Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA 12
1.4. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli 18
1.4.1. Đặc điểm của E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp .18
1.4.2. Các chủng E. coli thường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp .20
1.5. Các hệ thống vector biểu hiện trong E. coli .24
1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST 24
1.5.2. Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis 25
1.5.3. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL .27
1.5.4. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP .27
1.6. Phương pháp lên men vi sinh vật 28
1.6.1. Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp 28
1.6.2. Đặc điểm lên men mẻ .29
1.6.3. Đặc điểm lên men liên tục 32
1.6.4. Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung .32
1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E. coli để sản xuấtprotein tái tổ hợp .34
1.7. Các bước xử lý sau lên men để thu nhận mini-proinsulin và insulin có hoạt tính 39
1.7.1. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa mini-proinsulin .39
1.7.2. Tái gấp cuộn mini-proinsulin tái tổ hợp 40
1.7.3. Cắt loại đoạn peptide C để thu nhận insulin có hoạt tính .43
1.7.4. Các bước xử lý để thu nhận protein mục tiêu từ protein dung hợp .44
1.7.5. Các phương pháp tinh chế trung gian và tinh chế hoàn tất trong sản xuất insulin từ mini-proinsulin .45
1.8. Qui trình sản xuất insulin tái tổ hợp theo mô hình mini-proinsulin .47
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP .49
2.1. Dụng cụ và thiết bị .49
2.1.1. Thiết bị chính dùng trong sinh học phân tử .49
2.1.2. Thiết bị dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh 49
2.1.3. Thiết bị dùng cho tinh chế protein 49
2.1.4. Thiết bị dùng xác định hàm lượng đường huyết 50
2.2. Hóa chất và môi trường 50
2.2.1. Hóa chất 50
2.2.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh .55
2.3. Nguyên vật liệu 55
2.3.1. Chủng vi sinh vật .55
2.3.2. Plasmid 56
2.3.3. Mồi dùng cho tổng hợp gen, tạo dòng và giải trình tự 56
2.3.4. Thang phân tử lượng dùng trong điện di .57
2.3.5. Các kháng thể sử dụng cho Western Blot và ELISA 57
2.4. Phương pháp .58
2.4.1. Thiết kế, tổng hợp gen mpi mã hóa 6xHis-MPI trong E. coli bằng phương pháp PCR tái tổ hợp 58
2.4.2. Tạo dòng gen mpi trong plasmid pBlue (pBIns) 61
2.4.3. Tái tạo dòng gen mpi vào vector biểu hiện pET-43.1a .62
2.4.4. Cảm ứng biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của 6xHis-MPI .63
2.4.5. Hoạt hóa chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 66
2.4.6. Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 66
2.4.7. Khảo sát thay thế trypton bằng pepton trong môi trường LB nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 68
2.4.8. Khảo sát sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins được nuôi cấy trong môi trường LBp và LB 68
2.4.9. Khảo sát điều kiện nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins mật độ cao bằng phương pháp mẻ-bổ sung ở qui mô phòng thí nghiệm 69
2.4.10. Khảo sát điều kiện lên men E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins bằng nuôi cấy mẻ-bổ sung ở qui mô pilot 30L .70
2.4.11. Phương pháp thu sinh khối và đồng nhất tế bào .71
2.4.12. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa 6xHis-MPI .72
2.4.13. Thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI bằng sắc ký cột Ni-NTA 72
2.4.14. Phương pháp cắt loại bỏ 6xHis bằng CNBr để thu nhận MPI 72
2.4.15. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng lên sự tái gấp cuộn của MPI .73
2.4.16. Tủa mini-proinsulin và insulin bằng ion kẽm kim loại .75
2.4.17. Phương pháp xử lý MPI bằng trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận insulin có hoạt tính 75
2.4.18. Kiểm tra cấu hình của MPI và insulin bằng phương pháp ELISA .76
2.4.19. Phân tích MPI và insulin bằng sắc ký RP-HPLC .77
2.4.20. Giải trình tự amino acid của MPI bằng khối phổ .77
2.4.21. Phương pháp định lượng protein .77
2.4.22. Phương pháp xác định tính hoạt tính của insulin tái tổ hợp 79
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 80
3.1. Tạo dòng tế bào E. coli có khả năng biểu hiện mini-proinsulin dung hợp với 6xHis (6xHis-MPI) .80
3.1.1. Tổng hợp gen mpi mã hóa mini-proinsulin biểu hiện trong E. coli .80
3.1.2. Tạo dòng gen mpi vào plasmid pBlue 81
3.1.3. Tạo dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET43Ins biểu hiện MPI ở dạng dung hợp 6xHis-MPI 83
3.1.4. Kiểm tra trình tự amino acid của 6xHis-MPI 87
3.2. Lên men E. coli BL21(DE3)/pET43Ins tổng hợp 6xHis-MPI tái tổ hợp ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô pilot 89
3.2.1. Hoạt hóa, nhân giống và kiểm tra khả năng biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 89
3.2.2. Khảo sát các điều kiện biểu hiện tối ưu 6xHis-MPI của E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 91
3.2.3. Xác định điều kiện nuôi cấy mật độ cao chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins ở qui mô phòng thí nghiệm .95
3.2.4. Nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins theo phương thức mẻ- bổ sung ở qui mô 30 L để tổng hợp 6xHis-MPI .101
3.3. Thu nhận MPI có cấu hình tự nhiên 104
3.3.1. Thu nhận thể vùi chứa 6xHis-MPI 104
3.3.2. Thu nhận 6xHis-MPI từ thể vùi .105
3.3.3. Thu nhận MPI từ 6xHis-MPI .107
3.4. Thu nhận insulin từ MPI .111
3.4.1. Tái gấp cuộn MPI 111
3.4.2. Cắt loại peptide C bằng trypsin .116
3.5. Kiểm tra hoạt tính của insulin tái tổ hợp trên chuột .118
3.6. Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất insulin ở qui mô pilot 119
KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ .122
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 124
TÀI LIỆU THAM KHẢO 125
PHỤ LỤC .132