Tiến Sĩ Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận Tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc đ

Luận án tiến sĩ năm 2013
Đề tài: Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận Tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc Việt Nam


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮVIẾT TẮT .iii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒTHỊ .ix
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. TETRODOTOXIN .2
1.1.1. Công thức phân tử, cấu tạo hóa học của TTX 2
1.1.2. Đặc tính của TTX 4
1.1.3. Cơchếgây độc của TTX .5
1.1.4. Ứng dụng của TTX 7
1.2. NGUỒN THU NHẬN TTX 9
1.2.1. TTX từ động vật biển .9
1.2.2. TTX từvi sinh vật biển .15
1.3. CÔNG NGHỆTÁCH CHIẾT VÀTINH SẠCH TTX TỪCÁ NÓC .20
1.3.1. Tổng hợp TTX theo phương pháp hóa học .20
1.3.2. Tách chiết và tinhsạch TTX từcá nóc .21
1.4. THU NHẬN VÀ TINH SẠCHTTX TỪVI SINH VẬT .24
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊNGHIÊN CỨU .26
2.1.1. Đối tượng 26
2.1.2. Thiết bịnghiên cứu .26
2.1.3. Hóa chất và môi trường nghiên cứu .27
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28
2.2.1. Phương pháp xác định độc tốcủa 3 loài cá nóc độc bằng HPLC .28
2.2.2. Phương pháp phân tích, xác định tính chất của TTX từcá nóc Việt Nam làm tiền
đềkiểm chứng tính chất TTX từvi sinh vật 28
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu phân lập các chủng vi khuẩn có khảnăng sinh TTX 29
2.2.4. Phương pháp phân loại các chủng vi khuẩn có khảnăng sản sinh TTX 30
2.2.5. Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy vi khuẩn sản sinh TTX .33
2.2.6. Tối ưu hóa điều kiện nuôi vi khuẩn sinh TTX theo đường dốc của Box-Wilson 34
2.2.7. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệtách chiết vàtinh sạch TTX từdịch nuôi
vi khuẩn .36
2.2.8. Phương pháp phân tích xác định độc tính của TTX từvi sinh vật .39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN 41
3.1. PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT ĐỘC TỐTTX CỦA CÁ NÓC
ĐỘC VIỆT NAM 41
3.1.1. Lựa chọn mẫu vật đểphân lập vi sinh vật từcá nóc độc .41
v
3.1.2. Nghiên cứu xác định tính chất TTX từmẫu cá nóc độc Việt Nam 43
3.2. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SẢN SINH TTX TỪCÁ
NÓC ĐỘC VIỆT NAM .48
3.2.1. Phân lập và lựa chọn các chủng vi sinh vật từ3 loài cá nóc độc 48
3.2.2. Lựa chọn các chủng vi khuẩn sinh TTX từcác loại mô khác nhau của cá nóc độc49
3.2.3. Nghiên cứu khảnăng sinh TTX của các chủng vi sinh vật thu được 51
3.2.3. Phân loại các chủng vi sinh vật có khảnăng sản sinh TTX .52
3.3. NGHIÊN CỨU XÂYDỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VIKHUẨN SẢN SINH TTX .59
3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 59
3.3.2. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy .61
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độnuôi cấy .63
3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 64
3.3.5. Ảnh hưởng của tỷlệbổsung mô trứng cá nóc độc vào môi trường nuôi cấy 64
3.3.6. Ảnh hưởng của tỷlệcấp giống .65
3.3.7. Ảnh hưởng của tốc độkhuấy thích hợp 66
3.4. TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG M37 SẢN SINH TTX .67
3.4.1. Chọn miền khảo sát 67
3.4.2. Thiết lập mô hình 69
3.4.3. Tối ưu hóa khảnăng sinh độc tốTTX của chủng M37 theo phương pháp lên dốc
của Box-Wilson .72
3.4.4. Kiểm định mô hình tối ưu khảnăng sinh TTX của chủng M37 bằng thực nghiệm73
3.5. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆTÁCH CHIẾT VÀ TINH
SẠCH TTX TỪDỊCH NUÔI VI KHUẨN M37 76
3.5.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệtách chiết TTX ngoại bào từdịch nuôi vi
khuẩn M37 76
3.5.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệtinh sạch TTX từdịch độc tốthô chứa
TTX tách chiết từdịch nuôi vi khuẩn 77
3.6. KIỂM TRA CHẾPHẨM TTX TỪVI SINH VẬT 89
3.6.1. Kiểm tra chếphẩm TTX từvi sinh vật 89
3.6.2. Thửnghiệm độc tính cấp của TTX thu nhận từdịch nuôi chủng vi khuẩn M37 .90
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92
1. KẾT LUẬN .92
2. KIẾN NGHỊ .92
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 93
TÀI LIỆU THAM KHẢO .94
PHỤLỤC 102


MỞ ĐẦU
Tetrodotoxin (TTX) là một độc tốsinh học cực mạnh được chiết xuất chủyếu từcá
nóc độc, động vật biển và một sốchủng vi sinh vật. Trong những năm gần đây, TTX đã
được nghiên cứu sửdụng làmthuốc gây tê, gây mê, . ởnhiều nước nhưCanada, Mỹ,
Trung Quốc Ởnước ta, Dư Đình Động và cộng sựnghiên cứu thành công việc sửdụng
TTX kết hợp với bài thuốc dân tộc cổtruyền đểlàm thuốc cai nghiện, đã được tiến hành
thửnghiệmtrên các bệnh nhân cho kết quảkhảquan [9].
Những năm trước đây, để đáp ứng được nhu cầu của thịtrường, một sốnghiên cứu
đã sinh tổng hợp TTX theo phương pháp hoá học. Tuy nhiên, giá thành của sản phẩmTTX
tổng hợp hóa học cao, độtinh sạch thấp, không kinh tếbằng phương pháp tách chiết TTX
trực tiếp từcá nóc độc. Vì vậy, TTX được tách chiết chủyếu từcá nóc độc hoặc động vật
biển. Do hàmlượng TTX từcá nóc độc rất thấp (100kg trứng cá nóc độc mới táchchiết
được 1g TTX) nên giá thành của TTX rất cao. Hơn nữa, trữlượng của các loài cá nóc độc
ngày càng giảm,trong khi nhu cầu tiêu thụTTX lại ngày càng tăng [93].
Gần đây, các nghiên cứu thu nhận TTX từvi sinh vật đã mởra một triển vọng mới
trong công nghệsinh học. Hướng nghiên cứu cho phép chủ động sản xuất TTX trong
phòng thí nghiệm hoặc ởquy môcông nghiệp, độtinh sạch cao, giảm được giá thành, .
Xuất phát từý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề
tài “Nghiên cứu công nghệnuôi cấy và thu nhận Tetrodotoxin từmột sốchủng vi
khuẩn phân lập từcá nóc độc Việt Nam”.
* Mục tiêu nghiên cứu:
Xây dựng được quy trình công nghệtừphân lập, nuôi cấy, tách chiết và xác định
tính chất, độc tính TTX của vi khuẩn.
* Nội dung nghiên cứu:
- Phân lập và lựa chọn chủng vi sinh vật sản sinh TTX từcá nóc độc Việt Nam.
- Xây dựng quy trình công nghệnuôi cấy vi khuẩn sinh TTX.
- Xây dựng quy trình công nghệtáchchiết vàtinh sạch TTX từdịch nuôi cấy vi khuẩn.
- Xác định tính chất và độc tính của TTX từdịch nuôi cấy vi khuẩn.
* Những đóng góp mới của Luận án:
Lần đầu tiên ởViệt Nam, nghiên cứu có hệthống vềTTX từvi khuẩn (từphân lập,
nuôi cấy, tách chiết, tinh sạch và xác định tính chất của TTX từvi khuẩn).
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TETRODOTOXIN
Tetrodotoxin (TTX) là một chất độc sinh học, có hoạt tính sinh học cao, có bản chất
phi protein, khó bịphá hủy bởi nhiệt; là một hợp chất hữu cơdịvòng, có cấu trúc lưỡng
cực, có liênkết nội phân tửvới hemilactal và được phân loại nhưlà một hợp chất
aminohydroquinazoline [23].
1.1.1. Công thức phân tử, cấu tạo hóa học của TTX


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tài liệu tiếng Việt:
1. BộLao động-Thương binh và Xã hội (2012) Một năm tăng thêm gần khoảng
13.000 người nghiện ma túy. Báo Lao động, số210, 2012.
2. Đái Duy Ban (2009) Nghiên cứu sửdụng tetrodotoxin làm thuốc hỗtrợ điều trị
các bệnh tim mạch, ung thư, nghiện ma túy, nghiện thuốc lá, nghiện rượu và HIV/AIDS.
Nhà xuất bản Y học. Hà Nội.
3. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch,
Phạm Văn Ty (1972-1978) Một sốphương pháp nghiên cứu vi sinh vật.Tập 1, 2, 3. NXB
Khoa học Kỹthuật, Hà Nội.
4. Nguyễn Hữu Hoàng (2002) Tinh chếTetrodotoxin và phân tích hàm lượng
Tetrodotoxin từcá nóc bằng phương pháp khối phổ. Đại học Khoa học Tựnhiên - Đại
học Quốc gia Hà Nội.
5. Lê Quang Huấn, Lê Xuân Tú (1994) Tách chiết và tinh chếTTX từmột sốloài cá
nóc Tetrodontidae tại miền trung Việt nam. Tạp chí sinh học T.16 (3). 38-41.
6. Nguyễn Văn Lệ, Lê Xuân Tú, Bùi ThịThu Hiền, Shigeru SATO và CS (2006)
Nghiên cứu độc tính cá Nóc và các giải pháp xửlý chếbiến, quản lý từkhâu khai thác
đến khâu tiêu thụcá Nóc đảm bảo an toàn vệsinh thực phẩm. Báo cáo tổng kết đềtài
nghiên cứu khoa học, BộThuỷsản.
7. ĐỗTuyết Nga và cộng sự(2002) Phân tích độc tốtrong cá nóc, cua biển và một số
loài hải sản hai mảnh vỏ. Đềtài cấp cơsở. Viện Hải dương học Nha Trang.
8. Khuất Hữu Thanh (2006) CơsởDi truyền phân tửvà Kỹthuật gen. Nhà xuất bản
Khoa học và Kỹthuật, 2006.
9. Đào Cẩm Tú (2009) Căn cứkhoa học của thuốc cai nghiện Thiên Thanh Hoàn.
Báo An ninh thếgiới số789 ra ngày 27/6/2009.
10. Nguyễn Doãn Ý (2009) Xửlý sốliệu thực nghiệm trong kỹthuật.Nhà xuất bản
Khoa học và kỹthuật, 2009.
2. Tài liệu tiếng Anh:
11. Alfred E. B. (2001) Benson’s Microbiological Applications Lab Manual. Eighth
Edition, The McGraw- Hill Companies Press.
12. Are Klevan (2004) Classification of bacteria using oligonucleotide microarray:
an in silico experiment. Thesis for the degree of Siv.ing in Biotechnology. University of
Oslo, Norway.
13. B.A. Venmathi Maran, Emi Iwamoto, Jun Okuda, Shuhei Matsuda, Shigeto
Taniyama, Yasuo Shida, Manabu Asakawa, Susumu Ohtsuka, Toshihiro Nakai, Geoffrey
95
A. Boxshall (2007) Isolation and charaterization of bacteria from the panther puffer
Takifugu pardalis with the emphasis on TTX. Toxincon. Vol 50, pp 779 – 790.
14. Bragadeeswaran S, Therasa D, Prabhu K, Kathiresan K (2010) Biomedical and
pharmacological potential of tetrodotoxin-producing bacteria isolated from marine
pufferfish Arothron hispidus (Muller, 1841). The Journal of Venomous Animals and
Toxins including Tropical Diseases. ISSN 1678-9199, 2010,Vol 16 (3), pp. 421-431.
15. Chen C. Y., Chou H. N. (1998) Detection of tetrodotoxinby high performance
liquid chromatography in lined-moon shell and puffer fish. Acta Zoologica Taiwanica, 9
(1), pp. 41-48.
16. Deng Y, Fan Yan, Xue D elin, Liu Li, Hu Jiang chun, Wang Shujin (2008) Study
on the Fermentation of Tetrodotoxin by Bacillus fusiforms N141. NatProd R es Dev
2008, Vol20, pp. 74-78.
17. D. Bryniok, Trösch W (1989) ELISA techniques for the determination of
methanogenic bacteria. Applied Microbiology Biotechnology, vol 32, pp.235–242.
18. Do. H. K, K. Hamasaki, K. Ohwada, U. Simidu, T. Noguchi, Y. Shida, and K.
Kogure (1993) Presence of Tetrodotoxin and Tetrodotoxin-Producing Bacteria in
Freshwater Sediments. Appl. Environ. Microbiol., 59 (11), p. 3934-3937.
19. Duff H.J., Sheldon R.S and Cannon N.J (1988) Tetrodotoxin sodium channel
specific anti arrhythamic activity. Cardio vascular Research. GBR. Vol 22, pp 800-807.
20. Elam K-S, Fuhrman F-A, Kim Y-H, Mosher H-S (1977). Neurotoxins from three
species of California goby: Clevelandiaios, Acanthogobius flavimanus, and Gillichthys
mirabilis. Toxicon, Vol 15, pp. 45–49.
21. Fuhrman, F. A. (1986) Tetrodotoxin, tarichatoxin, and chiriquitoxin: Historical
Perspectives.Tetrodotoxin, saxitoxin, and the molecular biology of the sodium channel.
New York Academy of Sciences, Vol 479.
22. Gabor, E.M., de Vries, E.J., Janssen, D.B. (2003) Efficient recovery of
environmental DNA for expression cloning by indirect extraction methods.FEMS
Microbiology Ecology 44, 153–163.
23. Goto T., Takahashi S., Kishi Y. and Hirata Y. (1965) Tetrodotoxin. Tetrahedron.
21, pp 2059-2088.
24. Goto.T, Takahashi.S., Kishi Y and Hirata Y. (1964) An extraction and
purification of tetrodotoxin. J.Chem.Jan. 85, 508.
25. Guimei Yang, Jilin Xu, Shenghua Liang, Daming Ren, Xiaojun Yan, Baolong
Bao (2010) A novel TTX-producing Aeromonas isolated from the ovary of Takifugu
obscurus. Toxicon 56 (2010), pp. 324-329.
26. Hashimoto Y. (1979). In Marine Toxins and Other Bioactive Metabolites.Japan
Scientific Societies Press: Tokyo, Japan, pp. 298–302.