Luận Văn Nghiên cứu con đường xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm (Lates calcarifer) và đá

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Nghiên cứu con đường xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm (Lates calcarifer) và đánh giá khả năng phòng bệnh do Streptococcus iniae gây ra bằng cách ngâm cá trong vaccine


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN . i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
MỞ ĐẦU 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN 3
1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm. 3
1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Streptococcosis trên cá. . 4
1.2.1 Bệnh Streptococcosis. 4
1.2.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trên cá 5
1.2.2 Bệnh do Streptococcus iniea gây ra trên cá chẽm. 8
1.3. Vaccine 8
1.3.1 Tình hình nghiên cứu phát triển vacxin ở cá trên thế giới 9
1.3.2 Tình hình nghiên cứu vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên cá. . 10
1.3.3 Tình hình nghiên cứu và triển vọng sử dụng vacxin ở Việt Nam 13
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 14
2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu. . 14
2.2. Vật liệu nghiên cứu. 14
2.2.1. Môi trường. . 14
2.2.2. Hóa chất. 14
2.2.2.1. Hóa chất sản xuất vaccine, xác định đặc điểm sinh hóa. . 14
2.2.2.2. Hóa chất nhuộm mô hóa miễn dịch. . 14
2.2.3. Dụng cụ, thiết bị. 15
2.2.3.1. Nuôi cấy vi khuẩn, sản xuất vaccin và cắt mô. . 15
2.2.3.2. Xác định hiệu quả vaccin. 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu. 15
2.3.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu (Hình 2.1). . 15
2.3.2. Kiểm tra một số đặc điểm sinh hóa của hai chủng Streptococcus
iniae. 15
2.3.3 Nuôi cấy vi khuẩn và chuẩn bị vacxin Streptococcus iniae bất hoạt. 16
2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm và thu mẫu 18
2.2.4.2. Xử lý mẫu. . 18
2.2.4.3.Quy trình nhuộm mô hóa miễn dịch. . 18
2.2.5. Phương pháp đánh giá hiệu quả vaccine. 19
2.2.5.1. Chuẩn bị cá thí nghiệm. 19
2.2.5.2 Xác định liều gây chết 50% (LD50) bằng phương pháp ngâm. . 21
2.2.6 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm ngược, xác định tỷ lệ sinh tồn tương
đối RPS (%). 21
2.2.7 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu . 21
2.2.7.1 Phương pháp xác định các thông số. 21
2.2.7.2 Phương pháp xử lý số liệu. 22
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. . 23
3.1 Các đặc điểm sinh hóa của hai chủng vi khuẩn Streptococcus inae. 23
3.2 Kết quả LD50 (%) và độc lực của chủng vi khuẩn Strep1 . 25
3.3 Sự xâm nhiễm của vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm. . 27
3.4 Đánh giá mức độ an toàn của vaccine . 31
3.5 Kết quả cảm nhiễm cá sau khi dẫn truyền vaccine và tỷ lệ sinh tồn tương
đối RPS (%). 33
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀXUẤT Ý KIẾN. 38
4.1. Kết luận. . 38
4.2. Đề xuất ý kiến. 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 39


MỞ ĐẦU
Nghề nuôi tôm sú đi vào giai đoạn thoái trào đã làm cho nghề nuôi trồng
thủy sản Việt Nam phải chuyển hướng sang những đối tượng thay thế mới. Trong
nỗ lực thay đổi đó, cá chẽm được đưa vào nghiên cứu và chuyển giao chongười
nuôi. Với ưu thế là tốc độ sinh trưởng khá nhanh, dễ nuôi, năng suất nuôi cao và có
giá trị kinh tế, cá chẽmđã dần dần là đối tượng nuôi quan trọng ở nhiều vùng nước
ta. Tuy nhiên, sự phát triển nghề nuôi cá chẽmgia tăng nhanh chóng cả về quy mô
và diện tích, đồng thời thiếu sự quản lý, quy hoạch trong quá trình phát triển trong
thời gian qua đã dẫn đến một số vấn đề về môi trường và dịch bệnh,kết quả là các
báo cáo dịch bệnh trên đối tượng nuôi này xuất hiện với tần số ngày càngtăng.
Một trong nhữngbệnh nguy hiểm và thường gặp đã được thông báo trên cá
chẽmcó thể kểđến là bệnh Streptococcosis do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra.
Bệnh đã được bắt gặp trên nhiều hệ thống nuôi cá chẽm ở Việt Nam và một sốquốc
gia trên thế giới với tỷ lệgây chếtlớnlên đến 70%trong một thời gian ngắn, gây
thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi. Kháng sinh, chất kích thích miễn
dịch và vaccine là những công cụ được ứng dụng để kiểm soát bệnh. Tuy nhiên, so
với vaccine, hai công cụ kháng sinh và chất kích thích miễn dịch còn thể hiện nhiều
hạn chế. Sử dụng kháng sinh có thểđể lại dư lượng trong cá, trong môi trường tạo
ra những tác động tiềm ẩn gây nguy hại cho môi trường và con người, từ đó dẫn đến
những sản phẩm dùng kháng sinh gặp phải e ngại của người tiêu dùng, gâykhó
khăn trong tiêu thụ. Sử dụng chất kích thích miễn dịch tuy an toàn với con người,
với môi trường và vật nuôi nhưng lại chỉtạo ra sự bảo vệ trongmột thời gian ngắn.
Do đó, sử dụng vaccine là phương pháp kiểm soát tối ưu được các nhàkhoa học
hướng đếnđể kiếm soát bệnh này.
Trên thế giới, vaccine phòng bệnh Streptococcosisđã được nghiên cứu từ
những năm 1980, trên thị trường cũng đã xuất hiện sản phẩm vaccine thương mại để
phòng bệnh S. iniae trên các loài cákhác nhau, nhưng ở Việt Nam lĩnh vực vaccine
còn rất mới. Với mục tiêu phát triển nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam nói chung,
nghề nuôi cá chẽmnói riêng hướng tới sự bền vững, thận thiện với môi trường và
an toàn với con người, các nỗ lực nghiên cứu đểhiểu hơn về tác nhân gây bệnh, từ
đósản xuất và đưa vaccine phòng bệnh Streptococcosistrên cá chẽm vào ứng dụng
đã và đang được thực hiện.
Được sự cho phép của khoa Nuôi trồng thủy sản, trường Đại học Nha Trang
và sự định hướng, giúp đỡcủa thầy Trần Vĩ Hích, tôi đã thực hiện đề tài tốt nghiệp
với tiêu đề: “Nghiên cứucon đường xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus
iniae vào cá chẽm (Lates calcarifer)vàđánh giá khả năng phòng bệnh do
Streptococcus iniaegây ra bằng cách ngâm cá trong vaccine”
Nội dung thực hiện:
1. Nghiên cứu conđường xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vàocá
chẽm.
2. Đánh giá khả năng phòng bệnh do Streptococcus iniaegây ra bằng cách
ngâm cá trong vaccine.
Mục tiêu của đề tài: Xác định con đường xâm nhập, phát triển của S. iniaevào
cá chẽm Lates calcarifervà hiệu quả của vaccinedẫn truyền bằng phương pháp
ngâm trongphòng trị bệnhdo S. iniaegây ra trên đối tượng này,từ đó làm cơ sở
khoa học cho những nghiên cứu tiến tới hoàn thiện quy trình sản xuất và sử dụng
vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên cá chẽm ở Việt Nam.
Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn, kiến thức còn hạn chế và bước đầu làm
quen với phương pháp nghiên cứu khoa học nên đồ án khó tránh khỏi những sai xót.
Kính mong các thầy cô cùng bạn đọc đóng góp ý kiến để đồ án được hoàn thiện
hơn.


PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm.
Cá Chẽmcó hệ thống phân loại như sau:
Ngành: Chordata
Lớp: Actinopterygii
Bộ: Perciformes
Họ: Centropomidae
Giống: Lates Hình 1.1.Cá chẽm Lates calcarifer
Loài: Lates calcarifer(Bloch, 1790)
Tên tiếng Việt: Cá chẽm, cá vược.
Tên tiếng Anh: Sea bass, Barramundi, Giant seaperch [9]
Cá chẽmcó thân hình thon dài và dẹp bên, cuống đuôi khuyết sâu. Chiều dài
thân bằng 2,7 –3,6 lần chiều cao. Đầu nhọn, nhìn bên cho thấy phía trên hơi lõm
xuống ở giữa và hơi lồi ở lưng. Miệng rộng và hơi so le, hàm trên kéo dài đến
phía dưới sau hốcmắt. Răng dạng nhung, không có răng nanh, trên nắp mang
có gai cứng, vây lưng gồm có 2 vi: vi trước có 7-9 gai cứng và vi sau có 10-11 tia
mềm. Vi hậu môn có 3 gai cứng, vi đuôi tròn và có hình quạt. Vẩy dạng lược và có
kích cỡ vừa phải, có 61 vẩyđường bên.
Khi cá còn khoẻ, trên mặt lưng có màu nâu, mặt bên và bụng có màu bạc khi
sống trong môi trường nước biển, màu nâu vàng khi sống trong môi trường nước
ngọt. Khi cá ở giai đoạn trưởng thành sẽ có màu xanh lục hay vàng nhạt trên lưng
và màu vàng bạc ở mặt bụng.
Cá chẽmphân bố rộng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc tây Thái Bình
Dương và Ấn Độ Dương, từ Đông Phi đến Papua New Guinea, từ nam Trung Quốc,
Đài Loan đến Bắc Úc. Tại Việt Nam, cá chẽm có thể được tìm thấy ở vịnh Bắc bộ,
vùng biển Trung và Nam Bộ.
Về khả năng thích ứng với các yếu tố sinh thái, cá chẽmlà loài có khả năng
thích ứng rộng với sự thay đổi độ mặn, cá giai đoạn giống và trưởng thành sống
được ở độ mặn từ 0 –35 pptvà có thể chịu đựng tốt với sự thay đổi độmặn đột
ngột. Thực tế cho thấy cá giống cỡ 2 –3 cm có thể thuần hóa từ độ mặn 30 –32 ppt
xuống 5 –10 ppttrong 2 –3 giờ (Kungvankij et al. 1984; Tucker, 2000) [1] . Vì
vậy, đây là loài rất thích hợp cho phát triển nuôi cả trong nước ngọt, nước lợ cũng
như nuôi biển (Kungvankij et al.1984; Schipp,1996) [1]. Cá chẽmcó thể thích ứng
với nhiệt độ từ 21 –39
o
C, thích hợp nhất 27 –30
o
C. Nhiệt độ thay đổi đột ngột
2 –3
o
C có thể gây sốc cho cá giống (Tucker, 2000) [ 1].Độ pH thích hợp cho cá từ
7,0 –8,5; DO 4 -9 ppm; NH
3
-N < 0,025 ppm, H2
S < 0,3 ppm(Kungvankij et al.
1984) [9] .
Cá chẽmlà loài cá dữ, ăn mồi sống và có khả năng ăn thịt đồng loại, đặc biệt tỉ
lệ chết do ăn nhau cao nhất ở giai đoạn từ 1 –10 cm. Ngoài tự nhiên, thức ăn của cá
chẽmgồm cá nhỏ, tôm, cua, mực
Cá chẽmlà loài có kích thước lớn, khối lượng tối đa có thể đạt 60 kg. Cá tăng
trưởng chậm ở giai đoạn đầu, khi đạt 20 – 30 g tốc độ tăng trưởng nhanh hơn và
chậm lại khi đạt khoảng 4 kg. Cá bột mới nở có chiều dài 1,49 mm, sau 40 ngày đạt
cỡ 17,4 mm, 50 ngày đạt 28,9 mm, 90 ngày đạt chiều dài 93 mm, khối lượng là 9 g
(Kungvankij et al.1984) [1].Trong điều kiện nuôi, cá giống cỡ 2 –2,5 cm sau thời
gian ương từ 30 –45 ngày đạt cỡ 5 –11 cm, sau từ 6 đến 24 tháng nuôi thương
phẩm cá đạt 0,35 –3 kg (Schipp, 1996) [1]. Cá chẽmnuôi tại Úc dễ dàng đạt > 0,6
kg sau 12 tháng nuôi. Tại các vùng có nhiệt độ cao, cá có thể đạt 0,8 kg sau 12
tháng, 3 kg sau 18 – 24 tháng (Tucker et al.2002) [1].
1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Streptococcosistrên cá.
1.2.1 BệnhStreptococcosis.
Streptococcosis là một bệnh thường gặp ở người, động vật trên cạn và cả ở
động vật thủy sản. Ở cá, Streptococcosis được xem là một phức hợp các bệnh giống


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt.
1. Lục Minh Diệp, 2011. Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nuôi thâm
canh cá chẽm Lates calcarifer(Bloch, 1790) bằng thức ăn công nghiệp. Hợp
phần hỗ trợ phát triển nuôi trồng thủy sản bền vững (suda), cơ quan chủ trì:
Trường Đại học Nha Trang.
2. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004.
Đại cương bệnh thủy sản. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 125 -166.
3. Nguyễn Xuân Nguyên, 2011. Tìm hiểumột số đáp ứng miễn dịch đặc hiệu
của cá chẽm(Lates calcarifer) sau khi tiêm chủng vi khuẩn Streptococcus
iniaeđã được bất hoạt bằng formallin. Đồ ántốt nghiệp Đại học, trường Đại
học Nha Trang.
4. Phạm Văn Thư. Sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản.Viện nghiên
cứu nuôi trồng thủy sản 1.
Tài liệu tiếng Anh.
5. Agnew, W. and Bartnes,A.C., 2007. Streptococcus iniae: an aquatic
pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for
reliable vaccination. Veterinary Microbiology 122: 1-15.
6. Akhlaghi, M., Munday, B.L. and Whittington, R.J.,1996. Comparison of
passive and active immunization of fish against streptococcosi (enterococc-osis ). Journal of Fish Diseases 19: 251-258.
7. Bachrach, G., Zlotkin, A., Hurvitz, A., Evans, D.L. and Eldar, A.,2001.
Recovery of Streptococcus iniaefrom diseased fish previously vaccinated
with a streptococcus vaccine. Applied Environmental Microbiology 67:
3756-3758.
8. Bercovier, H., Ghittino, C. and Eldar, A.,1997. Immunization with
bacterial antigens:infections with streptococci and related organisms. In: Fish
Vaccinology, R. Gudding, A. Lillehaug, P.J. Midtlyng and F. Brown (eds.).
S. Karger, Basel.
9. Buchanan, J.T., Stannard, J.A., Lauth, X., Ostland, V.E., Powell, H.C.,
Westerman, M. E. and Nizet,V.,2005. Streptococcus iniaephosphogluco-mutase is a virulence factor and a target for vaccine development. Infection
Immunulogy 73: 6935-6944.
10. Bromage, E. S., Thomas, A. and Owens, L.,1999. Streptococcus iniae, a
bacterial infection in barramundi Lates calcarifer. Diseases of Aquatic
Organisms 36: 177-181.
11. Bromage, E.S., Owens, L.,2002. Infection of barramundi Lates calcarifer
with Streptococcus iniae: effects of different routes of exposure.Diseases of
aquatic organisms 52: 199–205.
12. Cheong, L., 1989. Status of knowledge on farming of Seabass (Lates
calcarifer) in South East Asia. Advances In Tropical Aquaculture. 421-428.
13. Delamare-Deboutteville, J., D. Wood and A.C. Barnes.,2006.Response
and function of cutaneous mucosal and serum antibodies in barramundi
(Lates calcarifer) acclimated in seawater and freshwater. Fish and Shellfish
Immunology 21: 92-101.
14. Eldar, A., Horovitcz, A. and Bercovier, H.,1997. Development and
efficacy of a vaccine against Streptococcus iniaeinfection in farmed rainbow
trout. Veterinary Immunology and Immunopathology 56: 175-183.
15. Evans, J. J., Shoemaker, C. A. and Klesius, P. H.,2004.Efficacy of
Streptococcus agalactiae (group B) vaccine in tilapia (Oreochromis
niloticus) by intraperitonal and bath immersion administration. Vaccine 22:
3769-3773.
16. Ferguson, W., Morales, J. A., Ostland, V. E., 1994. Streptococcosis in
aquarium fish. Diseases Of Aquatic Organisms 19: 1-6.
17. Hich, T. V., Duzng, N. H., 2011. Experimental Streptococcus iniae
infection in barramundi (Lates calcarifer ). Book of abstracts symposium on
diseases in Asian Aquaculture 8 (96).
18. Ling, S. H. M., Wang, X. H., Lim T. M., Leung K. Y.,2001.Green
fluorescent protein-tagged Edwardsiella tardareveals portal of entry in fish.
FEMS Microbiology Letters 194:239-243.
19. Nguyen Thinh Huu, 2000. Study on the infection mechanism of
Streptococcus iniaein Japanese flounder ( Paralichthys olivaceus). Thesis
for degree of doctor of philosophy in Marine Science. Nagasaki University,
Japan.
20. Pier, G.B. and S.H.Madin.,1976. Streptococcus iniae sp.nov., a beta
hemolytic streptococcus isolated from an Amazon freshwater dolphin, Inia
geoffrensis. International Journal of Systematic Bacteriology 26: 545-553.
21. Sandlund, N., Torkildsen, L., Magnesen T., Mortensen, S., Bergh, O.
2006. Immunohistochemistry of great scallop Pecten maximuslarvae
experimentally challenged with pathogenic bacteria. Diseases Of Aquatic
Organisms 69: 163–173.
22. Shoemaker, C. A., P. H. Klesius and J. A. Plumb. 1997.Killing of
Edwardsiella ictaluriby macrophages from channel catfish immune and
susceptible to enteric septicemia of catfish. Veterinary Immunology and
Immmunopathology 58:181–190.
23. Shoemaker, C.A., Vanderberg, G.W., Désormeaux, A., Klesius P.H. and
Evans, J.J. 2006. Efficacy of a Streptococcus iniaemodified bacterin
delivered using Oralject technology in Nile tilapia (Oreochromis niloticus).
Aquaculture 255: 151-156.
24. Shoemaker, C. A. and Klesius, P. H. 2009. Use of modified live Vaccines
in Aquaculture. Journal of the world aquaculture society 40. 5.