Luận Văn Nghiên cứu cố định ENZYME UREASE trên bề mặt chất rắn

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kĩ thuật, ngày nay, công nghệ
enzyme đóng góp một phần không nhỏ vào sự phát triển của nhiều lĩnh vực. Nhiều
nghiên cứu về enzyme đã được tiến hành với các quy mô khác nhau và kết quả của các
nghiên cứu này đã được ứng dụng rất nhiều trong các ngành như công nghiệp thực
phẩm, y học, nông nghiệp Trong lĩnh vực phân tích, các phương pháp hóa sinh sử dụng
enzyme với ưu điểm cho kết quả nhanh, độ chính xác cao đã dần dần thay thế các
phương pháp hóa học. Tuy nhiên, một trong những nhược điểm lớn nhất khi sử dụng
enzyme là giá thành của chúng quá cao làm tăng chi phí cho việc áp dụng vào phương
pháp phân tích hóa sinh. Vì vậy, một giải pháp được đưa ra cho vấn đề này là tái sử
dụng enzyme bằng cách cố định chúng lên các chất mang khác nhau. Từ đó, enzyme cố
định ra đời và ngày càng khẳng định được các ưu điểm vượt trội của mình.
Enzyme urease đã được nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng trong thực tế từ nhiều
năm nay. Một trong những ứng dụng quan trọng của urease là phân tích urea. Như chúng
ta đã biết hiện nay việc lạm dụng urea để gia tăng lượng nitơ tổng trong các sản phẩm
như nước mắm, sữa cũng như việc sử dụng urea để bảo quản thịt, thủy sản đang diễn ra
hết sức phổ biến. Điều này không đúng theo các quy định vệ sinh an toàn thực phẩm.
Bên cạnh đó, trong y học, việc xác định nồng độ urea trong các mẫu bệnh phẩm là một
trong những xét nghiệm rất quan trọng để đánh giá tình hình sức khỏe bệnh nhân. Như
vậy, cần có một phương pháp nhanh chóng để xác định chính xác lượng urea trong thực
phẩm và trong các mẫu bệnh phẩm, và đó chính là phương pháp sử dụng enzyme urease.
Như đã trình bày ở trên, việc áp dụng enzyme urease vào thực tế cũng vấp phải một
nhược điểm rất lớn là giá thành enzyme quá cao làm tăng chi phí của việc phân tích. Để
hạn chế nhược điểm này, việc sử dụng enzyme cố định được cho là giải pháp tốt nhất.
Từ những yêu cầu trên, trong phạm vi luận văn này, chúng tôi sẽ tiến hành
nghiên cứu phương pháp cố định enzyme urease và khảo sát một số tính chất của
enzyme urease cố định. Đó chính là những nghiên cứu tiền đề để tạo ra những màng
enzyme urease cố định đáp ứng đầy đủ các yêu cầu để có thể ứng dụng trong chế tạo
urease biosensor. Nội dung nghiên cứu bao gồm:
ã Nghiên cứu phương pháp cố định enzyme urease.
ã Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của phương pháp cố
định.
ã Khảo sát một số tính chất của enzyme urease cố định.
Chúng tôi hy vọng kết quả nghiên cứu này sẽ góp phần đưa ra được phương pháp
cố định và làm rõ tính chất của enzyme urease cố định nhằm tạo cơ sở cho việc áp dụng
các kết quả nghiên cứu vào việc phân tích urea sau này.


MỤC LỤC
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục bảng . vi
Danh mục hình vẽ vii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .1
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN. .3
2.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE .3
2.1.1 Giới thiệu chung về enzyme urease 3
2.1.2 Cấu tạo của enzyme urease .3
2.1.3 Cơ chế xúc tác 5
2.1.4 Cơ chất của enzyme urease .6
2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme urease .7
2.1.6 Nguồn phân bố enzyme urease .11
2.1.7 Ứng dụng của enzyme urease .15
2.2 SƠ LƯỢC VỀ ENZYME CỐ ĐỊNH 16
2.2.1 Giới thiệu 16
2.2.2 Các phương pháp cố định enzyme .18
2.3 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE CỐ ĐỊNH .20
2.3.1 Giới thiệu 20
iv
2.3.2 Các phương pháp cố định enzyme urease .20
2.3.3 Tính chất của enzyme urease cố định .21
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
3.1 NGUYÊN LIỆU 32
3.1.1 Enzyme urease .32
3.1.2 Chất mang .32
3.1.3 Hóa chất .34
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .34
3.2.1 Mục đích và nội dung nghiên cứu .34
3.2.2 Nghiên cứu xác định phương pháp cố định enzyme urease .35
3.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme urease lên chất mang
chitosan bằng phương pháp tạo liên kết cộng hóa trị 40
3.2.4 Xác định hiệu suất cố định 43
3.2.4 Khảo sát một số tính chất của enzyme urease cố định trên chất mang chitosan bằng
phương pháp tạo liên kết cộng hóa trị 44
3.2.5 Các phương pháp phân tích 48
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 52
4.1 NGHIÊN XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME UREASE 52
4.2 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH ENZYME
UREASE LÊN CHẤT MANG CHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT
CỘNG HÓA TRỊ .54
4.2.1 Ảnh hưởng của bề dày màng .54
4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch glutaraldehyde ngâm màng 55
4.2.3 Ảnh hưởng của thời gian ngâm màng trong dung dịch glutaraldehyde .57
4.2.4 Ảnh hưởng của pH dung dịch enzyme ngâm màng 58
4.2.5 Ảnh hưởng của thời gian ngâm màng trong dung dịch enzyme .60
4.3 HIỆU XUẤT CỐ ĐỊNH ENZYME UREASE TRÊN CHẤT MANG CHITOSAN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT CỘNG HÓA TRỊ .61
4.4 KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ENZYME UREASE CỐ ĐỊNH TRÊN CHẤT
MANG CHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT CỘNG HÓA TRỊ 63
4.4.1 Khảo sát tính chất động học của enzyme urease cố định 62
4.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme urease cố định 65
4.4.3 Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme urease cố định 66
4.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính của enzyme urease cố định .69
4.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của các loại đệm khác nhau đến hoạt tính của enzyme urease cố
định 70
4.4.6 Khảo sát khả năng bảo quản của enzyme urease cố định .71
4.4.7 Khảo sát chế độ bảo quản của enzyme urease cố định .73
4.4.8 Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme urease cố định 75
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN và KIẾN NGHỊ 77
5.1 KẾT LUẬN .77
5.2 KIẾN NGHỊ .79
Tài liệu tham khảo 80
Phụ lục .89

DANH MỤC BẢNG
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
Bảng 2.1: Kết quả thông số động học của enzyme urease từ đậu rựa tại các nhiệt độ khác
nhau 7
Bảng 2.2: Tính chất của một số loại enzyme urease từ các nguồn khác nhau 13
Bảng 2.3: Ưu – Nhược điểm của các phương pháp cố định enzyme 19
Bảng 2.4: Một số phương pháp cố định enzyme urease .22
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bảng 3.1: Thông số hóa lý của chitosan 33
Bảng 3.2: Một số chỉ tiêu chất lượng của gelatin 33
Bảng 3.3: Một số thông số hóa lý của glutaraldehyde .34
Bảng 3.4: Dãy dung dịch urea để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính
enzyme urease tự do .45
Bảng 3.5: Dãy dung dịch urea để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính
enzyme urease cố định .45
Bảng 3.6: Thành phần các ống nghiệm để lập đường chuẩn NH3 .49
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN
Bảng 4.1: Thông số động học của enzyme urease tự do và cố định trên chất mang chitosan
bằng liên kết cộng hóa trị .64
Bảng 4.2: Hằng số tốc độ vô hoạt enzyme và chu kỳ bán hủy của enzyme urease tự do và
cố định trên chất mang chitosan bằng liên kết cộng hóa trị 68
DANH MỤC HÌNH VẼ
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
Hình 2.1: Tinh thể urease được J.B.Sumner tách chiết và kết tinh 4
Hình 2.2: Cấu trúc phân tử enzyme urease .5
Hình 2.3: Cấu tạo trung tâm hoạt động của enzyme urease 5
Hình 2.4: Cơ chế xúc tác của enzyme urease .6
Hình 2.5: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme urease từ đậu rựa của
trường đại học Regensburg (Đức) 8
Hình 2.6: Độ bền nhiệt của enzyme urease tự do và cố định trên hạt chitosan xốp tại nhiệt
độ 70o
C trong đệm pH 7 27
Hình 2.7: Nhiệt độ tối ưu của enzyme ureae tự do và cố định trên hạt chitosan xốp trong
đệm pH 6.5 27
Hình 2.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme urease tự do và cố định trên màng
polymer từ gelatin và poly (HEMA) 28
Hình 2.9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme urease cố định trên màng hỗn hợp
chitosan – alginate và poly(acrylamide-co-acrylic acid)/κ-carrageenan 29
Hình 2.10: Aûnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cố định trên màng trao đổi ion 30
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hình 3.1: Cấu tạo của chitosan 32
Hình 3.2: Công thức cấu tạo của glutaraldehyde 34
Hình 3.3: Sơ đồ nghiên cứu 35
Hình 3.4: Sơ đồ phương pháp cố định enzyme urease bằng cách nhốt trong gel gelatin 37
Hình 3.5: Sơ đồ phương pháp cố định enzyme urease bằng cách tạo liên kết cộng hóa trị
nhờ cầu nối glutaraldehyde 39
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN
Hình 4.1: Đồ thị so sánh hoạt tính của enzyme urease cố định theo 3 phương pháp khác
nhau 52
Hình 4.2: Ảnh hưởng của thể tích dung dịch chitosan tạo màng đến hiệu quả của phương
pháp cố định 54
Hình 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch glutaraldehyde ngâm màng đến hiệu quả của
phương pháp cố định .55
Hình 4.4: Quá trình tạo liên kết giữa glutaraldehyde với chitosan và giữa phức hợp chitosan
– glutaraldehyde với enzyme .56
Hình 4.5: Ảnh hưởng của thời gian ngâm màng trong dung dịch glutaraldehyde đến hiệu
quả của phương pháp cố định .58
Hình 4.6: Ảnh hưởng của pH dung dịch enzyme ngâm màng đến hiệu quả của phương pháp
cố định .59
Hình 4.7: Ảnh hưởng của thời gian ngâm màng trong dung dịch enzyme để cố định đến hiệu
quả của phương pháp cố định .60
Hình 4.8: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của enzyme urease tự do và cố
định trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị 63
Hình 4.9: Đồ thị Lineweaver – Burk cho enzyme urease tự do và cố định trên màng
chitosan bằng liên kết cộng hóa trị 64
Hình 4.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme urease tự do và cố định trên
màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị 65
Hình 4.11: Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme urease tự do và cố định trên màng chitosan
bằng liên kết cộng hóa trị tại nhiệt độ 55o
C 67
Hình 4.12: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme urease tự do và cố định trên màng
chitosan bằng liên kết cộng hóa trị 69
Hình 4.13: Ảnh hưởng của các loại đệm khác nhau đến hoạt tính của enzyme urease cố
định trên màng chitosan bằng liên kết cộng hóa trị 71
Hình 4.14: Khả năng bảo quản của enzyme urease tự do và cố định trên màng chitosan
bằng liên kết cộng hóa trị trong dung dịch đệm phosphate 1/15 M, pH 7, EDTA 1 mM .72
Hình 4.15: Khảo sát chế độ bảo quản enzyme urease cố định trên màng chitosan bằng liên
kết cộng hóa trị 73
Hình 4.16: Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme urease cố định trên màng chitosan
bằng liên kết cộng hóa trị .75